基因工程第三章第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一載體定義分子克隆載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞的DNA分子。第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一載體特點

1.至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。

2.

至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。

3.

至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一載體種類質粒載體（plasmid)λ噬菌體的衍生物柯斯質粒（cosmid)單鏈DNA噬菌體M13動物病毒第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

第一節質粒載體一、質粒載體的一般生物學特征染色體DNA質粒DNA大腸桿菌細胞第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一1.定義:

質粒是染色體外能夠自主復制的雙鏈閉合環狀DNA分子。廣泛存在于細菌細胞中，在藍藻、霉菌、酵母甚至真菌細胞中都發現有質粒分子的存在。第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.質粒DNA的一般生物學特性（1）分子特性

a構型三種

SC型超螺旋L型線型OC型開環b分子量1-200kb第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（2）質粒的復制類型

根據質粒DNA復制與宿主之間的關系或質粒在宿主細胞中拷貝數的多少將質粒分為兩種類型：嚴緊型1-3個拷貝松弛型10-200個拷貝

第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（3）質粒的不親和性所謂質粒的不親和性（不相容性）是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種不同質粒不能在同一個宿主細胞系中穩定地的共存的現象。第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（4）質粒的轉移性

質粒的轉移性是指質粒從一個細胞轉移到另一個細胞的特性。

結合型：可自我轉移，大多為嚴緊型質粒非結合型：不可自我轉移，安全，為基因工程中常用。大多為松弛型質粒第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一二、理想質粒載體的必備條件1.天然質粒用作載體的局限性天然質粒是指沒有經過體外修飾改造的質粒具有分子量大，克隆能力低，拷貝數低，提取難度大，克隆位點有限，編碼基因具免疫篩選等不足之處。第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.理想質粒載體的必備條件：（1）分子量盡量小，（2）應最大限度的具有各種常用限制性內切酶的單一酶切位點，（3）具兩種以上的選擇標記基因；（4）缺失mob基因（5）重組質粒較易導入宿主細胞并復制和表達。第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一二、普通型載體pBR322pBR322的質粒圖第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一pBR322的構建過程1.PBR322質粒載體的構建第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一1.PBR322的一般生物學特性

aPBR322大小為4.363kb為松弛型質粒，復制起始點來源于pMB1b四環素抗性基因（Tetr)來源于pSC101c氨芐青霉素抗性基因（Ampr）來源于pSF2124d12種限制性內切酶的單一識別位點。分別位于Tetr和Ampr中第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.PBR322的優點

a分子量小4363bp

統一規定記數從EcoRI識別位點GAATTC的第一個T為1

b兩種抗生素抗性基因，可作為重組體的選擇標記，便于篩選重組體。

Tetr

基因內有7個酶切位點，

Ampr

基因內有3個酶切位點，

Ori內有2個酶切位點

插入失活：因插入外源DNA片段而使基因失活的現象c具有較高的拷貝數1000-3000/細胞

第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一用HeaⅡ消化PBR322使其缺失HeaⅡ的B和G片段，缺失了遷移蛋白基因（mob），增加了安全性3.PBR322的改良第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

為了克服EcoRI位點不具備插入失活效應這一缺點，引入具有EcoRI單一酶切位點的Cmlr基因，得到新質粒pBR325.第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一三、常用質粒載體類型（一）克隆質粒載體

克隆質粒載體是指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質粒載體。目前常用的克隆質粒載體有pBR322、pUC及其派生質粒載體。

第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一1.pBR322及其派生的質粒載體

pAT153pBR325

2.pUC系列的質粒載體

一種典型的pUC系列的質粒載體包括如下4個組成部分:(1)pBR322的復制起始點

(2)氨芐青霉素抗性基因

(３)ＬacZ’基因

(４)半乳糖苷酶的氨基端第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一pUC質粒載體的特點:1.具有更小的分子量

pUC8/pUC92750bppUC/18pUC192686bp2.利用組織化學法篩選重組體

3.具有多克隆位點

4.具有更高的拷貝數第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（二）表達質粒載體

表達質粒載體是指專用于在宿主細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體。

據所表達的蛋白是否分泌到細胞外可分為：非分泌型表達載體（胞內表達載體）分泌型表達載體據所用的受體細胞不同：原核細胞表達載體真核細胞表達載體第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（二）表達質粒載體表達質粒載體與克隆質粒載體的區別在于表達載體必須含有：1.強啟動子，2.在啟動子下游區和起始密碼子上游區有一個好的S-D序列3.在插入序列的下游區要有一個強轉錄終止序列，第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

三種表達型載體結構圖第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（三）穿梭質粒載體

所謂穿梭質粒載體是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而右在兩種不同的宿主細胞中存活和復制的質粒載體。常見的穿梭質粒有大腸桿菌-土壤農桿菌穿梭質粒載體、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體。第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（四）多功能質粒載體

這類載體具有多種功能，它可以根據需要進行體外轉錄、克隆、測序、基因表達等方面的基因操作。pGEM系列質粒載體就是一類多功能載體，如pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4z、pGEM3zf等。都是由pUC系列質粒載體派生而來的。第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第二節λ噬菌體載體

細菌質粒載體為基因克隆提供了快速、簡便的方法，但克隆能力在10kb左右。不能滿足構建文庫等的要求。為此人們把λ噬菌體發展成為一種優良的克隆載體。λ噬菌體是迄今為止研究最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈噬菌體。第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一一、λ噬菌體的生物學特性（一）

λ噬菌體的生活周期

λ噬菌體是一種中等大小的大腸桿菌噬體，由一個包裹著DNA的正二十面體蛋白質頭部和一個中空管狀的蛋白質尾部組成，屬溫和噬菌體。

第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一λ噬菌體是迄今為止研究最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈噬菌體，噬菌體DNA進入細菌細胞后，可有兩種生活周期：裂解周期和溶源周期。環狀分子整合到大腸桿菌染色體上，與染色體一起復制即溶源化的過程

λ噬菌體壟斷寄主的生化合成機制，產生大量雙鏈DNA分子并包裝進入Pro.外殼導致寄主細胞裂解。三個基因CⅠ、CⅡ、Cro產物間的平衡，來決定溶源和裂解。第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一溶源和裂解

λ基因表達分為早、中、晚期，早期產物用于和溶源化竟爭而確立裂解周期，中期DNA復制和重組，晚期與包裝DNA的蛋白有關。

CⅠ編碼的阻遏物形成產生溶源化現象，竟爭過程中若CⅠ阻遏物形成受阻，而Cro編碼的阻遏物形成進入裂解周期。CⅡ、CⅢ對溶源化的建立是必不可少的，但對維持溶源化不是必需。第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（二）λ噬菌體的基因組結構和功能

λ噬菌體DNA為環狀雙鏈分子，長度為4.85kb,兩端有12bp的單鏈互補的粘性末端左邊為5’-GGGCGGCGACCT-3’.

右邊為3’-CCCGCCGCTGGA-5’，可結合形成雙鏈區段（COS位點）是包裝的必需DNA序列。第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一COS位點的結構第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一（二）λ噬菌體的基因組結構和功能λDNA上至少定位了61個基因形成四個基因簇與基因表達調節有關的調節基因簇、與DNA重組及整合刪除有關的重組基因簇、與復制有關的復制基因簇、與頭尾蛋白質合成及組裝和裂解有關的結構基因簇第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一人為將其基因組分為三個區：左側區：包含外殼蛋白的全部編碼基因中間區：非必需區，被外源DNA片段取代后，不影響噬菌體的生命活動右側區：包含全部的主要調節基因及復制基因和裂解基因第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一二、λ噬菌體載體的構建

野生型的不直接適用于做基因克隆載體：1.λDNA基因組在而且復雜。其中具有常用RE的多個識別位點（5個BamHⅠ，5個EcoRⅠ,7個HindⅢ等）2.存在包裝限制，其只能容納大小為正常野生型總量的75％~105％的DNA分子。第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一其改造有以下幾個方面切除DNA的非必需區段，擴大其克隆容量切除必需的的RE識別位點，在非必需區引入合適的RE識別位點引入適當的選擇標記基因以便重組子的篩選通過在某些必需基因中引入無義突變使之成為安全載體，以利于生物學防護。第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一第三節單鏈噬菌體載體

M13、f1、fd是一類親緣關系密切的絲狀大腸桿菌噬菌體，它們都含有大小為6.4kb、彼此具有很高同源性的單鏈環狀DNA分子單鏈噬菌體載體主要是由M13噬菌體發展起來的一類載體。第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一.優越性aRFDNA（復制型雙鏈M13DNA）如同質粒DNA可體外純化和操作bRFDNA、SSDNA都能轉染寄主，并依實驗方法，產生噬菌斑或菌落c單鏈DNA噬菌體顆粒的大小受DNA多寡制約，因此對它們來說不存在包裝限制問題，即可以克隆大片段（6倍M13)d應用單鏈DNA噬菌體可以測定出外DNA的插入方向e可插入單鏈DNA分子，可應用Sanger測序，及寡核苷酸的定點突變。第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一一、M13噬菌體載體1.生物學特性

單鏈環狀DNA分子大小為6.4kb,通過性須或轉染將DNA（+）注入雄性大腸桿菌中，它不裂解寄主，受感染的細胞可繼續釋放大量新的M13。第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一過程

單鏈DNA即（+）鏈按基因Ⅱ基因Ⅳ方向轉錄形成（-）鏈DNA,轉變成雙鏈復制型（RF)，RFDNA可從細胞中分離提取出來，用作克隆的載體，當每個細胞內了100-200拷貝的RFDNA后，變為不對稱的只產生（+）。這些+鏈與細胞內積累的DNA結合蛋白結合形成噬菌體顆粒。第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一2.α-互補

aβ—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ’）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZ’(編碼146AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZ’）均可作為標記基因。

第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一bx-gal是一種無色的化合物，β-半乳糖苷酶能將x-gal切割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-氯靛藍。因此x-gal可作為β-半乳糖苷酶的一種指示劑。第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一

c在M13的IS區插入一個大腸桿菌的lac操縱子片段，它包括基因和起動子β—半乳糖苷酶基因的一部分（lacZ’）以及操縱基因和啟動子區域。lacZ’編碼β—半乳糖苷酶基因前面的146個氨基酸，稱為α–多肽。它能與部分缺失lacZ基因的大腸桿菌突變株（JM101細胞）進行α互補，產生完整的β—半乳糖苷酶?？蛇M行藍白斑篩選。JM101遺傳組成(Lacpro.)LacIqlacPOLac△zlacPOLac△zM13pFF染色體α受體α供體第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一利用菌落顏色篩選重組子第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期一