核酸類藥物生化制藥技術2023/4/111第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

概述

核酸類藥物分為兩類：一類為具有天然結構的核酸類物質,這類藥物已廣泛用于放射病(Co60)、血小板減少癥、白細胞減少癥、慢性肝炎、心血管疾病等，屬于這一類的核酸類藥物有ATP、輔酶A、脫氧核苷酸等。第二類為天然結構堿基、核苷、核苷酸結構類似物或聚合物，這類藥物是當今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要手段，也是產生干擾素、免疫抑制的臨床藥物，主要有三氟胸苷、疊氮胸苷、阿糖腺苷等。

反義核酸技術及反義藥物：反義技術是用人工合成的或生物中自然存在的寡聚核苷酸片斷（反義DNA和反義RNA），結合目標基因或mRNA特定序列(靶核酸)，從而有效地抑制或封閉基因的轉錄與翻譯。反義藥物能與特定基因雜交，在基因水平干擾致病蛋白的產生過程，即干擾遺傳信息從核酸向蛋白質的傳遞。2023/4/112第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

概述

核酸是由許多核苷酸以3’，5’-磷酸二酯鍵連接而成的大分子化合物。核苷酸由堿基、戊糖和磷酸三部分組成，堿基和戊糖組成的單元叫核苷。核酸類藥物包括核酸、核苷酸、核苷、堿基及其衍生物。依據化學結構和組成分四大類：

1核酸堿基及其衍生物

2核苷及其衍生物

3核苷酸及其衍生物

4多核苷酸（C）（U）（T）腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）β-D-核糖β-2-D-脫氧核糖2023/4/113第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五核酸的生產方法酶解法～是先用糖質原料、亞硫酸紙漿廢液或其他原料發酵生產酵母，再從酵母體中提取核糖核酸（RNA），提取出的核糖核酸經過青霉屬或鏈霉屬等微生物產生的酶進行酶解，制成各種核苷酸。半合成法～即微生物發酵和化學合成并用的方法。例如由發酵法先制成5-氨基4-甲酰胺咪唑核苷（AICAR），再用化學合成制成鳥苷酸。又如用發酵法先制成肌苷，再利用微生物的或化學的磷酸化作用，使肌苷轉變為肌苷酸。

2023/4/114第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五2023/4/115第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

核苷酸的制備

核酸(RNA主要存在于微生物中，如啤酒酵母、紙漿酵母以及多種抗生素的菌絲體；DNA主要存在于動物內臟等)經酶、酸、堿水解生成核苷酸，然后分離提取制備各種核苷酸的方法通稱水解核酸法。用催化劑的不同，分為酶水解、酸水解和堿水解等。

(1)酶水解最常用的酶有桔青霉A.S3.2788產生的5’—磷酸二酯酶，也可用紅酵母發酵所產生的3’—磷酸二酯酶。2023/4/116第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

核苷酸的制備

（2）堿水解法在稀堿條件下，RNA容易水解得到2’—核苷酸和3’—核苷酸。實際上這是由于稀堿水解過程中，先形成一個中間環狀物2’，3’環狀核苷酸，它很不穩定，進一步水解生成2’和3’—核苷酸。稀堿水解的濃度隨溫度和作用時間的不同而異。用1M氫氧化鉀或氫氧化納在80℃下作用1h能使RNA水解成單核苷酸；用0.3M氫氧化鉀或氫氧化納在37℃下作用，要16h。2023/4/117第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五從微生物中提取RNA是工業上最實際和有效的方法。一些最常見的菌體含有豐富的核酸，如酵母、白地霉、多中抗菌素（青梅素、制霉菌素等）的菌絲體。通常在細菌中RNA占5～25%，在酵母中占2.7～15%，在霉菌中占0.7～28%。菌體內RNA含量的變化受培養組成影響，其中關鍵是銨離子濃度和磷酸鹽濃度。培養酵母菌體收率高，易于提取RNA。在許多酵母中，早期細胞中的RNA含量高，其確切數值取決于C、H比例和培養基組成等。RNA來源2023/4/118第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五RNA的制備組織勻漿冷酸處理殘留物酸溶性小分子有機溶劑處理脂溶性物質殘留物酸處理堿處理酸提取液（RNA）殘留物（DNA）上清液（RNA等）沉淀物（DNA，蛋白質等）2023/4/119第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五實例2023/4/1110第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五提取與純化

乙醇沉淀法

提取去污劑沉淀法

酚法純化：密度梯度離心法

柱色譜法

凝膠電泳法2023/4/1111第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五RNA的含量測定RNA消化濃硫酸or過氯酸核苷酸、堿基、戊糖正磷酸+鉬酸，H+磷鉬酸還原劑鉬藍660nm處最大吸光度；分光光度法檢測。DNA含磷量：9.4%RNA含磷量：9.9%2023/4/1112第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝

三磷酸腺苷是體內廣泛存在的輔酶，是體內組織細胞所需能量的主要來源，蛋白質、脂肪、糖和核苷酸的合成都需ATP參與。ATP經腺苷酸環化酶催化形成環磷酸腺苷(cAMP)，是細胞內的生物活性物質，對細胞許多代謝過程有重要的調節作用。

ATP為蛋白質、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝細胞修復和再生，增強肝細胞代謝活性，對治療肝病有較大針對性。但外源性ATP不易進入細胞，且與體內需要的量比較，可能提供的量微不足道。2023/4/1113第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝

白色類白色粉末，易溶于水，難溶于有機溶劑。在水中的溶解度具有氫型＞鈉鹽＞鋇鹽＞汞鹽的順序。在堿性溶液(pHl0)及低溫下比較穩定。

ATP二鈉是兩性化合物。能與可溶性汞鹽和鋇鹽形成不溶于水的沉淀物，利用這種性質可分離ATP。

1、化學結構和性質2023/4/1114第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝

（1）工藝路線

2、以兔肌肉為原料強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂

2023/4/1115第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝①兔肉松的制備②提取取肉松加入4倍量冷蒸餾水，攪拌提取30min，過濾后再提取1次。合并2次濾液，冷處靜置3h，經布氏漏斗過濾至澄清，得提取液。

2、以兔肌肉為原料③吸附取處理好的氯型離子交換樹脂裝入層析柱，用pH3的水將柱平衡。提取液上柱流速控制在0.6一1ml／(cm2.min)左右，吸附ATP。上柱過程中用DEAE—C薄板檢查。

④洗脫飽和ATP柱，用pH3、0.03M氯化鈉液洗滌柱上滯留的AMP、ADP及無機鹽等，流速控制在1mL／(cm2.min)。再用pH3.8、1M氯化鈉液洗脫ATP，流速控制在0.3ml/(cm2.min)，收集洗脫液。操作溫度在0一10℃。2023/4/1116第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝⑤除熱原、雜質將洗脫液按總體積計加入0.6％的硅藻土，0.4％的活性炭攪拌10min，用4號垂熔漏斗過濾，收集ATP濾液。⑥結晶、干燥用6M鹽酸調濾液至pH2.5—3，在28℃的水浴中恒溫,加乙醇，不斷攪拌，使ATP二鈉結晶，用4號垂熔漏斗過濾，分別用無水乙醇、乙醚洗滌，收集ATP二鈉結晶，置五氧化二磷干燥器內真空干燥，即得ATP成品。次濾液，冷處靜置3h，經布氏漏斗過濾至澄清，得提取液。

2、以兔肌肉為原料2023/4/1117第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝

3、產氨短桿菌直接發酵法2023/4/1118第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝①菌種培養培養基組成葡萄糖10％，硫酸鎂1％，尿素0.3％，玉米漿適量，磷酸氫二鉀1％，磷酸二氫鉀1％pH7.2，接種量7—9％，pH控制在6.8—7.2。②發酵培養培養溫度30℃，36h，投入腺嘌呤，加尿素、氫氧化鈉和氨，控制pH。通風量1：0.5v／(v·min)。③提取、精制發酵液加熱使酶失活后，調節pH3—3.5，過濾，分離除去菌體，上清液通過769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脫，洗脫液再用CL-型陰離子交換樹脂吸附ATP，經氯化鈉—鹽酸液洗脫．洗脫液經醇沉，過濾，丙酮洗滌，脫水，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得ATP品。

3、產氨短桿菌直接發酵法2023/4/1119第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五

三磷酸腺苷生產工藝①應用兔肌肉為原料的提取法生產ATP，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白質，以鋇鹽和汞鹽純化ATP。此法耗用試劑多，成本高，易造成環境污染和直接危及操作人員身體健康。后改用蒸餾水提取ATP，樹脂精制純化從根本上解決了上述存在的問題．又可回收AMP、ADP，兔肉渣還可食用，總收率并不比汞鹽法低。②產氨短桿菌B1是生物素缺陷型菌株，其誘變菌株也依賴生物素作為生長因子。玉米漿中含有豐富的生物素，加入培養基中使ATP的產量顯著提高。4、注解

2023/4/1120第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五第六節輔酶A輔酶A（coenzymeA，CoA）由-巰基乙胺、4-磷酸泛酸和3，5-二磷酸腺苷所組成，是ADP的衍生物或類似物，分子量為767.54.高純度的CoA（95%）為白色無定形粉末，具有典型的硫醇味，有吸濕性，易溶于丙酮、乙醚和乙醇。CoA兼有核苷酸和硫醇的同性，與其他硫醇一樣，易被空氣、過氧化氫等氧化成無活性的二硫化合物，故制劑中宜加穩定劑（如半胱氨酸鹽酸鹽等），并最好充氮保存。CoA是乙酰基的載體，對酯類代謝、糖代謝、蛋白質代謝、甾醇的生物合成和乙酰化解毒等都起重要作用。2023/4/1121第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五生產工藝[吸附]人造沸石[絞碎]心漿[提取]水，硫酸提取液[離心，堿化]氨水堿化液吸附細胞色素C的沸石流出液[酸化]稀硝酸酸化液[吸附，洗滌]活性炭，水pH4.0吸附CoA的活性炭[洗脫]水，40%含氨乙醇洗脫液[濃縮，酸化]硝酸pH2.5～3，35℃上清液沉淀物CoA丙酮干粉[干燥]4℃[透析]水，4℃，48h透析外液[制劑]水，甘露醇，L-半胱氨酸pH5.5～6，凍干凍干品新鮮豬心[沉淀]丙酮pH2.5～3，4℃2023/4/1122第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五工藝過程1.酸化、吸附

沸石吸附細胞色素C后的流出液用稀硝酸調pH4.0，上活性炭柱，用蒸餾水洗株，在用40%乙醇洗至洗出液加10倍丙酮不出現白色渾濁為止。2.洗脫

用含3.2%氨的40%乙醇溶液洗脫，當流出液呈微黃色即開始收集，至pH10左右，停止收集。3.濃縮、酸化

洗脫液減壓濃縮至原體積1/10（外溫不超過60℃），用硝酸酸化至pH2.5～3.0，置冷庫過夜。次日離心，上清液繼續濃縮至原體積1/20左右。2023/4/1123第23頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五4.沉淀、干燥

濃縮液用硝酸調節pH2.5～3.0，在劇