抗原與抗體反應免疫檢測實驗原理和方法第1頁/共17頁二、沉淀反應

當抗原是可溶性分子時，與抗體結合則形成沉淀。1、絮狀沉淀反應一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的蛋白質沉淀。可用于尋找抗原抗體反應的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。2、環狀沉淀反應在試管中加入抗體后，小心加入相應抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現環狀沉淀。不能用于定量測定。第2頁/共17頁3、雙向擴散：又稱瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質的一種沉淀反應。瓊脂是多孔的網狀結構，可使大分子物質通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀。可觀測到沉淀弧。沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結構、擴散系數和濃度等。當抗原、抗體存在多種體系時，會出現多條沉淀弧。第3頁/共17頁雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。第4頁/共17頁

抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。第5頁/共17頁4、單向免疫擴散：又稱單向瓊脂擴散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內加入未知量的相應抗原。在37度保溫過程中，孔內的抗原向周圍擴散，與抗體形成沉淀圈。根據沉淀圈的大小確定抗原的含量第6頁/共17頁

另外還有其他眾多的免疫檢測技術和手段，其機理都利用了抗原抗體的沉淀反應。例如微量免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。只不過其檢測的對象和檢測的目的各有不同。第7頁/共17頁三、補體結合試驗

當抗體與細菌、紅細胞等顆粒抗原結合并形成抗原抗體復合物后，可結合補體引起溶菌、溶血效應。用補體結合試驗既可以測知患者血清中補體的總量，也可以檢測未知抗原或抗體的量。測定人血清補體總量的方法是以綿羊紅血球的溶血為指示。當綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結合后，加患者血清，觀測溶血程度。第8頁/共17頁

用于測定未知抗原/抗體時，采用兩套系統，一套是待測的抗原抗體系統，稱為檢測系統，一套是包括綿羊紅血球和抗綿羊紅血球抗體的指示系統。待測系統中有無待測得抗原/抗體是利用指示系統中是否出現溶血來判斷。反應的過程是首先加待測得抗原/抗體，反應一段時間后加入補體，在反應一段時間后加指示系統。有待測抗原抗體結合時，必然結合補體，不會出現溶血，沒有待測物質時出現溶血。第9頁/共17頁第10頁/共17頁四、熒光抗體技術

免疫熒光法是將熒光素與特異性血清抗體以化學方式結合起來，然后將此熒光標記了的抗體作為一種試劑在特定條件下浸染標本，使與標本中相應的抗原產生結合反應，再在熒光顯微鏡下，以紫外光為光源進行觀察。當出現熒光時，表明標記抗體存在，相應的抗原也存在。免疫熒光法有直接法和間接法兩種。第11頁/共17頁第12頁/共17頁第四節免疫親和層析

生物高分子具有能和某種相對應的專一分子可逆結合的特性，例如酶的活性中心或別構中心能和專一的底物、抑制劑、輔助因子效應劑通過某些次級鍵相結合，并在一定條件下又可以解離。抗體與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸等體系，都具有類似的特性。這種高分子和配基之間形成專一的可解離的復合物的能力稱為親和力。根據這種具有親和力的生物分子間可逆的結合和解離的原理發展起來的層析就稱為親和層析。第13頁/共17頁親和層析法的基本過程：1、偶聯：將欲分離的高分子物質的配基在不影響其生物功能的情況下與水不相溶性的載體結合，制成親和吸附劑或免疫吸附劑。2、裝柱：在層析柱內裝入固相化的配基3、親和層析：含有高分子物質的混合液在有利于配基和高分子之間形成復合物的條件下進入裝有親和吸附劑的層析柱。高分子物質結合留在柱內，其他雜質流出。4、洗脫：改變條件，促使配基和高分子物質分離而釋放出需要的物質。