微生物實驗課件實驗八質粒提取第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四一、質粒的一般生物學特性

質粒(plasmid)是獨立于細菌染色體以外的能自我復制的環狀閉合的雙股DNA，質粒DNA一般為細菌染色體的3%左右,作為基因克隆質粒載體的所有質粒DNA分子都必定包括如下三個共同的組成部分:復制基因、選擇標志基因和克隆位點。

質粒廣泛存在于細菌細胞中,此外在霉菌、藍藻、酵母和某些動植物細胞中也發現有質粒存在。

第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌乳糖操縱子簡介：

I:調節基因P:啟動子O:操縱基因

Z、Y、A:結構基因,其中Z編碼β-半乳糖甘酶(β-galactosidase),Y編碼透性酶(permease),A編碼乙酰基轉移酶(acetylase).IPOZYAOri:復制子．ＭＣＳ：multiplecloningsites,多克隆位點．第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四二、堿裂解法制備質粒DNA

注意點：使用酚－氯仿時注意安全三、瓊脂糖凝膠電泳技術（Agarosegelelectroghoresis）

注意點：制、看膠時，戴一次性手套，注意ＥＢ（溴化乙錠）第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四堿裂解法制備質粒DNA（書上的原理不完全正確）

染色體DNA分子大，易斷裂乘線型DNA分子質粒DNA共價閉合環型在堿性環境中線型的染色體DNA和環型的質粒DNA氫鍵發生斷裂，雙鏈解開而變性，但質粒DNA只部分發生斷裂，兩條互補鏈不會完全分離。當pH調至中性并在高鹽濃度存在的條件下，已分開的染色體DNA互補鏈不能復性，交聯形成不溶性網狀結構，通過離心，大部分染色體DNA、不穩定的大分子RNA和蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來。部分變性的質粒DNA在中性環境中很快復性，呈可溶狀態保存在溶液中，離心后，存在上清中。再通過酚、氯仿、乙醇沉淀，獲得純的DNA第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四

溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III，3M醋酸鉀/2M醋酸；溶液Ⅵ：酚：氯仿：異丙醇＝25：24：1所用溶液第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四質粒的提取p143（1）新鮮培養含有質粒的細菌（2）取1ml培養物加入1.5ml離心管中，10000rpm離心2min。（3）倒掉上清，盡可能倒干凈。（4）細菌沉淀重懸于100ul的溶液Ｉ中，用移液槍吹打至均勻。須確使細菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散(三種成分各發揮什么作用？）。第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四操作程序（5）加200μl新配制的溶液Ⅱ（問什么現配現用？怎樣發揮作用的？嚴格控制時間，為什么？）蓋緊管口，顛倒離心管幾次（不要振蕩），以混合內容物。應確保離心管的整個內表面均與溶液Ⅱ接觸。于室溫放置２-3分鐘至液體清亮。（6）加150μl的溶液Ⅲ

(2種成分發揮怎樣的作用？仔細觀察，發生了什么現象？）蓋緊管口，顛倒離心管幾次（不要振蕩），以混合內容物。應確保離心管的整個內表面均與溶液Ⅲ接觸。（7）4℃10000rpm離心10分種，立即將上清（400-450μl）轉移到另一離心管中。不要帶入沉淀，如有則用槍頭挑出。第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四操作程序（8）加等體積的溶液Ⅵ，振蕩、顛倒離心管幾次以沉淀DNA，于室溫放置２分鐘，小心吸取上層水相至另一潔凈的離心管中（為什么要用這3種試劑？）。（9）加入2倍體積的冷的無水乙醇，室溫放置２分鐘，10000rpm5min，在管底可見微量的DNA沉淀，小心吸棄上清液。（（10）加入1ml70%乙醇，將DNA沉淀懸浮起來后，4℃10000rpm離心５分鐘。（（11）小心吸棄上清液，將離心管倒置于一張紙巾上以吸盡液體。在室溫干燥10分鐘。（（12）取30μl滅菌水，用槍頭吹達沉淀，使其徹底溶解，取9μl的DNA樣品進行瓊脂糖電泳，其余-20℃保存備用。第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四電泳準備用透明膠封固玻璃板兩頭，在板一端放置電泳梳子。用1×TAE–buffer配制瓊脂糖凝膠(0.24gAgaros/32ml1×TAE–buffer)，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。待溶液冷卻至60℃，加入適量溴化乙錠至微紅，混勻。將溫熱的瓊脂糖凝膠倒入膠模中，凝膠厚度在5-7mm之間。在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心地將玻璃板移至裝有1×TAE–buffer的電泳槽中，輕輕地拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面。第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四DNA電泳取9μl的DNA樣品與1μl的10*樣品緩沖液混合后，用微量取樣器慢慢將混合物加至樣品孔中。蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽極移動。當溴酚藍在凝膠中移出適當距離（根據DNA的大小、1kb和3kb左右的指示劑來判斷）后，切斷電源，取出玻璃板，在紫外燈下觀察，并拍照記錄結果，估測質粒分子量的大小。第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四實驗要求每組同學看到質粒條帶估算出質粒條帶的分子量大小第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四實驗報告實驗目的實驗原理實驗步驟結果與分析思考題P145（1），（2），（3）下次實驗病毒的培養（雞胚接種）第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四病毒的分離與培養第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四實驗目的理解常規的病毒培養的基本方法掌握利用雞胚培養病毒的原理掌握雞胚接種的基本路徑學會雞胚的鑒別第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四病毒的種類專性活細胞寄生動物病毒雞胚接種細胞培養植物病毒細菌病毒第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四從病料中分離病毒一、樣本的采集與處理1、一般原則：合適的時間，合適的病變部位，合適的處理和保存方法

一般都要4℃保存第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四2、病料的種類動物樣本：（1）心、肝、肺、脾、腎臟和淋巴結等實質性器官（2）各種液體病料（3）腸內容物和腸壁（4）皮膚病料（5）骨（6）腦、脊髓植物樣本：發病植株的根、莖、葉、花、果等；第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四采集病料應具有針對性：在采集病料時應有重點地采集有關臟器、內容物、分泌物、排泄物或其他材料。在無法估計病因時，可全面采集病料。進行流行病學調查、抗體檢測、群體健康評估或環境衛生檢測時，樣品的采集數量不能太少，應具統計學意義。B.無菌采樣：采集所用的器械、樣品管等均應消毒滅菌，采集過程應保持無菌操作，不同個體、不同組織樣品應作好標。C.采集新鮮病料：動物發病后應立即采集病料，否則，尸體腐敗會影響采樣和檢測效果，特別是用于病理學檢查的病料更應及時采集。第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四3、送檢病料樣本的標記（1）送檢病料的物種、年齡、性別、發病日期、死亡時間等。（2）流行病學、臨床表現、病理剖檢等等初步診斷材料。（3）免疫接種和用藥治療情況。（4）病料中是否加有一些特殊的保護劑。（5）送檢的目的和要求。（6）姓名和聯系方式。第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四4、待檢病毒材料的處理：（1）組織材料需經剪碎、研磨后，以漢克氏液作1：10稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各1000IU，再反復凍融3次，使病毒從細胞中釋放出來，3000-4000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液微孔濾膜過濾后作為接種物。（2）分泌物、糞便等材料則可直接以漢克氏液作1：10稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各1000IU，4℃放置過夜，3000-4000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液作為接種物。（3）接種物在接種前需做細菌培養試驗，只有無菌接種物才可進一步使用。（4）植物樣本經剪碎、研磨、離心、過濾后接種植株第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四雞胚接種基本原理雞胚培養的優點：雞胚作為病毒的敏感細胞，能支持病毒完成從吸附到基因組復制，轉錄，蛋白質合成，裝配，裂解的整個生命過程，從而使得病毒得以繁殖