錨蛋白重復序列傳導力 機械力轉導通道打WeiZhang,LiE.Cheng,MaikeKitmann,JiefuLi,MajaPetkovic,TongCheng,PengJin,ZhenhaoGuo,MartinC.G?pfert,LilyYehJan,YuhNungJan時感受器電位（TRP）的NOMPC通道是一種作用于果蠅觸覺聽覺感知的假說，認為這些錨蛋白重復序列作為將力傳導至通道的系繩。本文中，我們N末端的錨蛋白重復序列形成了一個胞質域，其對于體外NOMPC機械力錨蛋白重復序列將延長將機械力敏感性神經元中NOMPC牽引到微管上的絲。除此之外，微管的連接對于NOMPC的機械力門控是必需的。重要的是，所得嵌合體通道同樣呈現出機械力敏感性。這些實驗有力地支持了NOMPC通在將力傳導至通道““過程中共同總用。已有大量支持細菌MscL通道和真核生物鉀離子通道的膜力模型，然而系繩模型的直接分子少之又少。TRP通道中，NOMPCARNOMPC作用于幼蟲運動中至關重要。NOMPC基本滿足真正機械力轉導通道的所有條件，究。NOMPCAR在機械力轉導過程中作為系繩的可這項研究中，我們測試帶有不同AR刪除或的NOMPC突變體，發現29AR的完整性對于體外表達系統及體內觸覺受體神經元中的NOMPC機械門控NOMPC機械敏感性至關重要。為測定Kv1.2Kv2.1中，使用超過去極化可達到NOMPCNOMPCNAR的作用，我們首先評估了其相對于細胞膜的NOMPC蛋白不同區域的抗體對細胞進行通透性表位抗體(αNOMPC-EC;圖1A)，該抗體可在非通透條件下識別質膜中的(αNOMPC-N-ter1A)C端的抗體(αNOMPC-C-ter1A)均在通透處理TRP通道。錨蛋白重復序列對于NOMPC膜表達 通道亞基預測結構的拓撲學簡圖。洋紅標記表明本使用抗體被識別的位使用孔螺旋（αNOMPC-EC）、NOMPCN末端（αNOMPC-N-ter）和NOMPCC（αNOMPC-C-ter）NOMPC蛋白進行非通透處理的染色（比例尺，10μm）(C)對NOMPC蛋白進行通透處理染色(D–K)分子結構簡圖，表面染色（比例尺，5μm）ARNOMPC0mV（灰色和-60mV（黑色時進行電流（比例尺，10pA）右邊的條形圖呈現表明NOMPC染色的熒光強度（F.intensity）（相對強度，n=2810101125121729。在不同倍數全長和Δ1-12AR-NOMPC之間進行配對t檢驗，???p<0.001）。全長NOMPC刪除29個AR的NOMPC13-29ARNOMPC16-29ARNOMPC刪除1-12AR的NOMPC將前12個AR與后17兩倍AR重復的NOMPC17ARNOMPC膜定位正常所有誤差線表示±標準誤也可見圖S1，圖S2和ARNOMPC使用識別NOMPC胞外域的抗體（αNOMPC-EC）對細胞膜上的NOMPC17ARΔ1-12AR的表現類似于N14-18AR的低溫敏TRPA11217ARARΔ13-29AR含有前12個AR)測試AR的兩個區域是否存在差異。當后17個ARΔ13-29AR-NOMPC)的表面表達量和開放概率(1H,S2A,andS2B)12AR17個NOMPC蛋白折疊，組裝或膜定位是必需的。此外，只有顯示表面表達的突變體和野生型(WT)NOMPC蛋白顯示自發通道活動(圖ARNOMPCNOMPCAR介導了機械力轉導通道的門控。為檢驗該理論的NOMPC(29+29AR-NOMPC)顯示機械門控(2Aand2B)。盡管對膜片區域上NOMPC介導的電流ARNOMPC介導的更大(2C,紅條)，然而根據表面表達水平進行與野生型NOMPC處于同一水平(圖2C,黑條)。相比之下，即使突變體Δ1-12AR-NOMPC29+17AR-NOMPC蛋白都有表面表達和自發通道活動，用同一壓力使膜變形并不能引起其應答(圖2A–2C)。自發通道活動可能來自物Gd3+阻斷(圖S2C)AR的完整性對于NOMPC通道的機械力轉導是（B）機械門控性電流振幅（絕對值）圖（n=12,11,8,7。單因素方差分析后進行???p12,11,8,7Tukey???p<0.001）(EF)應答壓力（E）(n107)及壓電位移（F）(n10687)NOMPC機械門控性電S2細胞并在全細胞結構下記錄應答時，可得到類似結果(2D)。這些機械性門控電流振幅取決于機械力刺激的強度(2Eand2F)。特別地，當不存在機械刺激時，Δ1-12AR-NOMPCNOMPC更有可能開放(圖S2AandS2B)。因此，NOMPC29AR的結構完整性對機械門控至關重要，其可能通過形成一個螺旋的全幅轉彎進行力轉導。對NOMPC門控的ARNOMPC果蠅幼蟲體壁第三類多樹突（da）神經元感受溫和觸覺，依賴于NOMPC的機械力轉導。nompC無效突變使神經元不再產生觸碰激發的應答。為研究NOMPCAR在這些機械力感受神經元中所起作用，我們檢測由第三類多樹突神Gal4激活蛋白（19-12-Gal4）ARNOMPC通道29+29AR- 均能被運往樹突的質膜。然而，第三類多樹突神經元中現象在異源細胞中也被發現1J)移動體壁20μm象(圖3Band3C)。第三類多樹突神經元中野生型NOMPCAR重復(29+29AR)NOMPC的表達能恢復突變表型的觸覺激發應答，而29+17AR,Δ1-29AR,或Δ1-12AR的NOMPC則不行3Band3C)29+29AR的的部分修復可能與較低的表達水平相關S3AandS3B)。結合圖二體外實驗29ARNOMPC通道在體內機械力感受功能體內NOMPC通道功能依賴錨野生型和NOMPC突變體在nompC無效突變體中第三類多樹突神經元的表達（比例尺，第三類多樹突神經元對機械力刺激的應答，揭示全長NOMPC和29+29AR- nompC空白表型的功能恢復，而其他突變的NOMPC通道ompC無效突變體幼蟲缺失的觸覺應答可通過表達全長NOMPC或2+2AR-NOMPC得以恢復，而通過第三類多樹突神經元特異性Gl4（1912-Gl4在第三類多樹突神經元中激活其他突變NOMPC通道則不表現這種作用。我們使用非成對t檢驗進行兩組間比較，并進行單因素方差分析及Tkey比較以分析3或4組數據。s,無顯著差異。??p<.01,p<.0.所有誤差線表示標準誤。型如下：w1118nompCnompC1/nompC3.(全長NOMPC):nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-NOMPC-GFP.Δ1-29AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-29AR-NOMPC-GFP.Δ1-12AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-12AR-NOMPC-GFP.29+17AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-29+17AR-NOMPC-GFP.NOMPC-介導的幼蟲觸覺依 的表達，可恢復其觸覺敏感性(3D)Δ1-29AR,Δ1-12AR,或29+17AR的NOMPC通道則不行。AR是膜-狀連接，即膜-微管連接器（MMCs）MMCNOMPCAR則排列可使用電子顯微鏡辨別出4A)，基于對其良好的解剖基礎，我們使用實定位于野生型果蠅（”NOMPC+“），nompC1-無效4A–4CandS4)NOMPC29+29AR-NOMPCMMCs明顯增長（MMC平均長度±標準差：18±5nm[NOMPC29+29AR]，15±5nm154nm[NOMPC29+29AR],124nm[NOMPC+])(4D).AR是膜-微管連接器的重平衡棒鐘形感受器樹突狀尖端的總體結構（比例尺果蠅平衡棒鐘形機械力受體機械敏感性樹突狀尖端的橫截面，描繪了細胞外鞘、細胞膜、微管和膜-微管連接器（MMCs，箭頭）。MMCs在NOMPC+野生型果蠅（左圖）中呈現，但在ompC1無效突變體（NOMP-,中圖）中不再呈現。經由NOMPC-GAL4在無效突變體中表達2+2AR-NOMPC，恢復MMC（NOMP2929A右圖（比例尺，20nmMMCs特寫（上），MMC臨摹圖（底）。對于每一種壓力，呈現小（左）和大（右）微管-膜間距離的樣本（比例尺，20nm。紅線突MMC的結構）。MMCs相連接的微管片段計算而得的NOMPC+NOMPC-,NOMPC29+29AR果MMC的相對豐度。NOMPC29+29ARMMCNOMPC+果蠅中類似(p0.05)，而NOMPCNOMPC果蠅中豐度存在顯著差異(p0.001,Bonferroni校正Mann-WhitneyU-檢驗；分析的鐘形受體數量:31(NOMPC+),24(NOMPC-),41+)--的膜-???顯著差異p0.001,使用BonferroniMann-WhitneyU-檢驗如此超結構效應；據，NOMPC蛋白的丟失很大程度上并不會改變微管-膜間距離，暗示MMC調整張力以適應預設的距離。然而，當我們系統分析NOMPCNOMPC果蠅膜-nompC無效[NOMPC?]，124nm[NOMPC+])(4D)MMC似乎將膜與微管拉29+29AR-NOMPC的果蠅中，微管-NOMPC+和NOMPC?果蠅(圖4D)中發現的顯著不同，介于二者之間。NOMPC據，異源表達NOMPC蛋白質在培養細胞中也與微管相連。NOMPC表面附近區域尤為明顯(圖5A)。使用NOMPC抗體(αNOMPC-EC)對非通透性NOMPC通道于微管共定位(5B)。道與膜附近皮層微管相互作用的概念相一致(圖5CandS5A)。S2細胞中NOMPC表達不能改變微管分布(S5B)NOMPC蛋白是否與微管結微管強烈相互作用(圖5D)，說明NOMPC通道可能與細胞中的微管相結合。圖5NOMPC通道與微管的連接對于機械門控至關重要面附近0.35μm中心平面。NOMPCS2NOMPC和微管進行染色（比例尺，5μm）。取蓋片表面附近0.35μm中心平面。TIRF顯微鏡顯示細胞皮層區域的膜NOMPC和微管間相互作用（比例尺，1μm）NOMPC形成細胞裂解液或微管蛋白親和層析純化物的共沉淀測定 有微管蛋白?MT,無微管蛋白S,上層清液P,顆粒諾考達唑對NOMPC機械門控電流阻礙的時程（0-150s間的配對t檢驗，p0.001,n=6）。,t檢驗n6and6)。膜片保持電壓+60mV50mmHg負壓。向生理鹽水中加入諾考達唑(100nMn7)或秋水仙胺(10μMn6)，該電壓降低，加入紫杉醇(10nMn6)卻不變（比例尺，50pA.???p0.001N.S.:統計不顯著，配對t檢驗）(I)+60mV下NOMPC的機械門控電流達到50mmHg負壓，向生理鹽水中加入細胞松弛素D(10nM,n=6)、微絲解聚素A(1μM,n=6)或jaskinolide(100nM,n=7)均無影響（比例尺，50pA.N.S.,統計不顯著，配對t檢驗）。鑒于近期涉及TRPV1通道與微管在滲透誘導的細胞收縮過程中的相互NOMPC機械門控中必需。在內面向外膜片中，向對機械力刺激的應答電流大大降低(圖5E)。在細胞吸附模式中諾考達唑同樣有相似效應(5Fand5G)NOMPCNOMPC在質膜中的表達水平沒有影響(圖S5DandS5E)NOMPCKv1.2Kv2.1通道電壓門控無影響(S5F–S5I)。化學成分NOMPC通道門控有類似的效應，NOMPC活動無影響(5H)，進一步說明微管對NOMPC機械門控至關重要。相比之下，穩定或破壞肌動蛋白細胞骨架對NOMPCKvARARNOMPC轉移至其他離子通道是否依然能體現機TRP29AR(M1-S1268fromNOMPC)NOMPCN-末端胞漿域和Kv1.2跨膜（TM）C末端(G160-V499fromKv1.2)，構建嵌合蛋白(S1268-G160-Kv1.2chimera)(6A)。為檢測此嵌合體通道是否有機械力刺激門控能力，我們對從經轉染的S2細胞中獲得的外面向外膜片施加Cs+則不能觸發(6Band6C)NOMPCS1前的連接體對機械力轉導非常重要，因為不含該連接體(M1-M1120fromNOMPC)，而NOMPCARKv1.2C末端(G160-V499fromKv1.2)的嵌合體通道(M1120-G160-Kv1.2chimera)不具有機械敏感性(圖6Band6C)。為確證機械敏感性電流實際上來源于S1268-G160-Kv1.2嵌合體，我們檢測了特定Kv1.2通道阻遏劑蝎毒素（MTX），這是一種能阻遏嵌合體通道的機械敏感性電流的毒素(6D)NOMPC的通道活動并無影響(S6AandS6B)。NOMPC錨蛋白重復序列將機械敏感性賦予KvNOMPCKv1.2Kv2.1構建嵌合通道的策略。用黑點強調界定蛋白質片段邊界嵌合體通道S126-G160Kv.2對負壓導致的膜變形顯示機械門控電流，而Cs+溶液中不存在這種現象（灰色軌跡）。而全長Kv1.2（WTKv.2），N末端截短的Kv.(Kv1.ΔNtrmins)和M112-G16-Kv1.2嵌合體均對同一刺激無應答。外面向外膜片保持電壓0mV。機械門控電流振幅圖(n2681077.單因素方差分析后進行Tukey???p機械門控電流被蝎毒（MTX）部分阻擋（???p0.001,t檢驗n對負壓引起膜變形顯示機械門控電流，而全長Kv2.1(WTKv2.1)、N末端截短的60mV。Kv1.2沒有表現出機械敏感性(6Band6C)，但的跨膜區域和C末端，構建嵌合通道(圖6A)，而據Kv2.1不具有機械敏感性。嵌合通道(S1268-V182-Kv2.1chimera)AR-Kv1.2嵌合通道類似的機械敏感性，而野生型Kv2.1、缺少N-末端胞漿域的Kv2.1(Kv2.1ΔNterminus)和不含連接體而包含NOMPCAR、Kv2.1TM域和C末端的嵌合通道(M1120-G182-Kv2.1chimera)沒有機械敏感性(6Eand6F)。NOMPC振幅(2E7BandS7B)。S1268-G160-Kv1.2嵌合通道產生的機械敏感性電流在持續壓力刺激的應答上呈現出適應現象(圖7C)。機械敏感性嵌合通道的生物物當施加壓力增大時（壓力在10mmHg-50mmHg范圍內每次增加10mmHg），AR-Kv1.2 的機械門控電流對于壓力的劑量依賴性曲線AR-Kv1.2嵌合通道產生的機械門控電流表現對持續刺激的適應。膜片持續壓強60mVKv1.2通道、AR-Kv1.2嵌合通道與微管共標記（比例尺，5μm；方框強調微(FG)Kv1.2（F）AR-Kv1.2嵌合通道（G）的代表性(H)野生型Kv1.2和AR-Kv1.2嵌合通道在存在或不存在機械刺況下的I-V曲線，100mV下標準化至沒有機械刺激的電流（灰色虛線強調V1/2處的電流-電壓關系）。膜片保持-80mVn4))(K)WTKv2.1AR-Kv2.1嵌合通道在有或無機械刺激下I-V100mV下標準化至沒有機械刺激的電流（灰色虛線強調V1/2處的電流-電壓關系。膜片保持電壓-80mV(WTKv2.1n=4，嵌合通道n=5)。所有誤差線表示±標準誤。又見圖嵌合通道表現出微管的相互作用，這與NOMPC通道類似，且比野生型Kv通道更顯著(圖7EandS7C)。用諾考達唑破壞微管后將大大消除嵌合通道的機械力應答(7D)，而對于野生型Kv1.2通道則沒有影響(S5FandS5G)AR-Kv1.2嵌合通道產生的機械門控電流同樣依賴于微管的完整性。這些實驗為AR電流，Kv1.2(圖7F–7H)和Kv2.1(7I–7K)經過標準化后的電流(I/Imax)電壓相關性均被左移。通過在每個膜去極化步驟中向AR-Kv嵌合通道的膜片施加50mmHg壓力脈沖，我們對處于接近去極化終點附近平臺期的電流，及去極化I-V曲線，Kv1.27H)Kv2.1(7K)12.1mV28mV，而對于野AR的轉移也賦予了含有電壓感受器和Kv1.2或Kv2.1的孔道的嵌合通道機械ARNOMPCMMC的成我們的分析記錄了NOMPCAR將延長MMC，這支持之前關于AR是不足以加倍其長度。由于測定僅限于二維平面，而的錨蛋白可能更為緊密，電子顯微鏡不能解決這種情況，則長度增