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文檔簡介

錨蛋白重復(fù)序列傳導(dǎo)力 機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通道打WeiZhang,LiE.Cheng,MaikeKitmann,JiefuLi,MajaPetkovic,TongCheng,PengJin,ZhenhaoGuo,MartinC.G?pfert,LilyYehJan,YuhNungJan時感受器電位(TRP)的NOMPC通道是一種作用于果蠅觸覺聽覺感知的假說,認為這些錨蛋白重復(fù)序列作為將力傳導(dǎo)至通道的系繩。本文中,我們N末端的錨蛋白重復(fù)序列形成了一個胞質(zhì)域,其對于體外NOMPC機械力錨蛋白重復(fù)序列將延長將機械力敏感性神經(jīng)元中NOMPC牽引到微管上的絲。除此之外,微管的連接對于NOMPC的機械力門控是必需的。重要的是,所得嵌合體通道同樣呈現(xiàn)出機械力敏感性。這些實驗有力地支持了NOMPC通在將力傳導(dǎo)至通道““過程中共同總用。已有大量支持細菌MscL通道和真核生物鉀離子通道的膜力模型,然而系繩模型的直接分子少之又少。TRP通道中,NOMPCARNOMPC作用于幼蟲運動中至關(guān)重要。NOMPC基本滿足真正機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的所有條件,究。NOMPCAR在機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中作為系繩的可這項研究中,我們測試帶有不同AR刪除或的NOMPC突變體,發(fā)現(xiàn)29AR的完整性對于體外表達系統(tǒng)及體內(nèi)觸覺受體神經(jīng)元中的NOMPC機械門控NOMPC機械敏感性至關(guān)重要。為測定Kv1.2Kv2.1中,使用超過去極化可達到NOMPCNOMPCNAR的作用,我們首先評估了其相對于細胞膜的NOMPC蛋白不同區(qū)域的抗體對細胞進行通透性表位抗體(αNOMPC-EC;圖1A),該抗體可在非通透條件下識別質(zhì)膜中的(αNOMPC-N-ter1A)C端的抗體(αNOMPC-C-ter1A)均在通透處理TRP通道。錨蛋白重復(fù)序列對于NOMPC膜表達 通道亞基預(yù)測結(jié)構(gòu)的拓撲學(xué)簡圖。洋紅標記表明本使用抗體被識別的位使用孔螺旋(αNOMPC-EC)、NOMPCN末端(αNOMPC-N-ter)和NOMPCC(αNOMPC-C-ter)NOMPC蛋白進行非通透處理的染色(比例尺,10μm)(C)對NOMPC蛋白進行通透處理染色(D–K)分子結(jié)構(gòu)簡圖,表面染色(比例尺,5μm)ARNOMPC0mV(灰色和-60mV(黑色時進行電流(比例尺,10pA)右邊的條形圖呈現(xiàn)表明NOMPC染色的熒光強度(F.intensity)(相對強度,n=2810101125121729。在不同倍數(shù)全長和Δ1-12AR-NOMPC之間進行配對t檢驗,???p<0.001)。全長NOMPC刪除29個AR的NOMPC13-29ARNOMPC16-29ARNOMPC刪除1-12AR的NOMPC將前12個AR與后17兩倍AR重復(fù)的NOMPC17ARNOMPC膜定位正常所有誤差線表示±標準誤也可見圖S1,圖S2和ARNOMPC使用識別NOMPC胞外域的抗體(αNOMPC-EC)對細胞膜上的NOMPC17ARΔ1-12AR的表現(xiàn)類似于N14-18AR的低溫敏TRPA11217ARARΔ13-29AR含有前12個AR)測試AR的兩個區(qū)域是否存在差異。當后17個ARΔ13-29AR-NOMPC)的表面表達量和開放概率(1H,S2A,andS2B)12AR17個NOMPC蛋白折疊,組裝或膜定位是必需的。此外,只有顯示表面表達的突變體和野生型(WT)NOMPC蛋白顯示自發(fā)通道活動(圖ARNOMPCNOMPCAR介導(dǎo)了機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的門控。為檢驗該理論的NOMPC(29+29AR-NOMPC)顯示機械門控(2Aand2B)。盡管對膜片區(qū)域上NOMPC介導(dǎo)的電流ARNOMPC介導(dǎo)的更大(2C,紅條),然而根據(jù)表面表達水平進行與野生型NOMPC處于同一水平(圖2C,黑條)。相比之下,即使突變體Δ1-12AR-NOMPC29+17AR-NOMPC蛋白都有表面表達和自發(fā)通道活動,用同一壓力使膜變形并不能引起其應(yīng)答(圖2A–2C)。自發(fā)通道活動可能來自物Gd3+阻斷(圖S2C)AR的完整性對于NOMPC通道的機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)是(B)機械門控性電流振幅(絕對值)圖(n=12,11,8,7。單因素方差分析后進行???p12,11,8,7Tukey???p<0.001)(EF)應(yīng)答壓力(E)(n107)及壓電位移(F)(n10687)NOMPC機械門控性電S2細胞并在全細胞結(jié)構(gòu)下記錄應(yīng)答時,可得到類似結(jié)果(2D)。這些機械性門控電流振幅取決于機械力刺激的強度(2Eand2F)。特別地,當不存在機械刺激時,Δ1-12AR-NOMPCNOMPC更有可能開放(圖S2AandS2B)。因此,NOMPC29AR的結(jié)構(gòu)完整性對機械門控至關(guān)重要,其可能通過形成一個螺旋的全幅轉(zhuǎn)彎進行力轉(zhuǎn)導(dǎo)。對NOMPC門控的ARNOMPC果蠅幼蟲體壁第三類多樹突(da)神經(jīng)元感受溫和觸覺,依賴于NOMPC的機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)。nompC無效突變使神經(jīng)元不再產(chǎn)生觸碰激發(fā)的應(yīng)答。為研究NOMPCAR在這些機械力感受神經(jīng)元中所起作用,我們檢測由第三類多樹突神Gal4激活蛋白(19-12-Gal4)ARNOMPC通道29+29AR- 均能被運往樹突的質(zhì)膜。然而,第三類多樹突神經(jīng)元中現(xiàn)象在異源細胞中也被發(fā)現(xiàn)1J)移動體壁20μm象(圖3Band3C)。第三類多樹突神經(jīng)元中野生型NOMPCAR重復(fù)(29+29AR)NOMPC的表達能恢復(fù)突變表型的觸覺激發(fā)應(yīng)答,而29+17AR,Δ1-29AR,或Δ1-12AR的NOMPC則不行3Band3C)29+29AR的的部分修復(fù)可能與較低的表達水平相關(guān)S3AandS3B)。結(jié)合圖二體外實驗29ARNOMPC通道在體內(nèi)機械力感受功能體內(nèi)NOMPC通道功能依賴錨野生型和NOMPC突變體在nompC無效突變體中第三類多樹突神經(jīng)元的表達(比例尺,第三類多樹突神經(jīng)元對機械力刺激的應(yīng)答,揭示全長NOMPC和29+29AR- nompC空白表型的功能恢復(fù),而其他突變的NOMPC通道ompC無效突變體幼蟲缺失的觸覺應(yīng)答可通過表達全長NOMPC或2+2AR-NOMPC得以恢復(fù),而通過第三類多樹突神經(jīng)元特異性Gl4(1912-Gl4在第三類多樹突神經(jīng)元中激活其他突變NOMPC通道則不表現(xiàn)這種作用。我們使用非成對t檢驗進行兩組間比較,并進行單因素方差分析及Tkey比較以分析3或4組數(shù)據(jù)。s,無顯著差異。??p<.01,p<.0.所有誤差線表示標準誤。型如下:w1118nompCnompC1/nompC3.(全長NOMPC):nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-NOMPC-GFP.Δ1-29AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-29AR-NOMPC-GFP.Δ1-12AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-12AR-NOMPC-GFP.29+17AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-29+17AR-NOMPC-GFP.NOMPC-介導(dǎo)的幼蟲觸覺依 的表達,可恢復(fù)其觸覺敏感性(3D)Δ1-29AR,Δ1-12AR,或29+17AR的NOMPC通道則不行。AR是膜-狀連接,即膜-微管連接器(MMCs)MMCNOMPCAR則排列可使用電子顯微鏡辨別出4A),基于對其良好的解剖基礎(chǔ),我們使用實定位于野生型果蠅(”NOMPC+“),nompC1-無效4A–4CandS4)NOMPC29+29AR-NOMPCMMCs明顯增長(MMC平均長度±標準差:18±5nm[NOMPC29+29AR],15±5nm154nm[NOMPC29+29AR],124nm[NOMPC+])(4D).AR是膜-微管連接器的重平衡棒鐘形感受器樹突狀尖端的總體結(jié)構(gòu)(比例尺果蠅平衡棒鐘形機械力受體機械敏感性樹突狀尖端的橫截面,描繪了細胞外鞘、細胞膜、微管和膜-微管連接器(MMCs,箭頭)。MMCs在NOMPC+野生型果蠅(左圖)中呈現(xiàn),但在ompC1無效突變體(NOMP-,中圖)中不再呈現(xiàn)。經(jīng)由NOMPC-GAL4在無效突變體中表達2+2AR-NOMPC,恢復(fù)MMC(NOMP2929A右圖(比例尺,20nmMMCs特寫(上),MMC臨摹圖(底)。對于每一種壓力,呈現(xiàn)小(左)和大(右)微管-膜間距離的樣本(比例尺,20nm。紅線突MMC的結(jié)構(gòu))。MMCs相連接的微管片段計算而得的NOMPC+NOMPC-,NOMPC29+29AR果MMC的相對豐度。NOMPC29+29ARMMCNOMPC+果蠅中類似(p0.05),而NOMPCNOMPC果蠅中豐度存在顯著差異(p0.001,Bonferroni校正Mann-WhitneyU-檢驗;分析的鐘形受體數(shù)量:31(NOMPC+),24(NOMPC-),41+)--的膜-???顯著差異p0.001,使用BonferroniMann-WhitneyU-檢驗如此超結(jié)構(gòu)效應(yīng);據(jù),NOMPC蛋白的丟失很大程度上并不會改變微管-膜間距離,暗示MMC調(diào)整張力以適應(yīng)預(yù)設(shè)的距離。然而,當我們系統(tǒng)分析NOMPCNOMPC果蠅膜-nompC無效[NOMPC?],124nm[NOMPC+])(4D)MMC似乎將膜與微管拉29+29AR-NOMPC的果蠅中,微管-NOMPC+和NOMPC?果蠅(圖4D)中發(fā)現(xiàn)的顯著不同,介于二者之間。NOMPC據(jù),異源表達NOMPC蛋白質(zhì)在培養(yǎng)細胞中也與微管相連。NOMPC表面附近區(qū)域尤為明顯(圖5A)。使用NOMPC抗體(αNOMPC-EC)對非通透性NOMPC通道于微管共定位(5B)。道與膜附近皮層微管相互作用的概念相一致(圖5CandS5A)。S2細胞中NOMPC表達不能改變微管分布(S5B)NOMPC蛋白是否與微管結(jié)微管強烈相互作用(圖5D),說明NOMPC通道可能與細胞中的微管相結(jié)合。圖5NOMPC通道與微管的連接對于機械門控至關(guān)重要面附近0.35μm中心平面。NOMPCS2NOMPC和微管進行染色(比例尺,5μm)。取蓋片表面附近0.35μm中心平面。TIRF顯微鏡顯示細胞皮層區(qū)域的膜NOMPC和微管間相互作用(比例尺,1μm)NOMPC形成細胞裂解液或微管蛋白親和層析純化物的共沉淀測定 有微管蛋白?MT,無微管蛋白S,上層清液P,顆粒諾考達唑?qū)OMPC機械門控電流阻礙的時程(0-150s間的配對t檢驗,p0.001,n=6)。,t檢驗n6and6)。膜片保持電壓+60mV50mmHg負壓。向生理鹽水中加入諾考達唑(100nMn7)或秋水仙胺(10μMn6),該電壓降低,加入紫杉醇(10nMn6)卻不變(比例尺,50pA.???p0.001N.S.:統(tǒng)計不顯著,配對t檢驗)(I)+60mV下NOMPC的機械門控電流達到50mmHg負壓,向生理鹽水中加入細胞松弛素D(10nM,n=6)、微絲解聚素A(1μM,n=6)或jaskinolide(100nM,n=7)均無影響(比例尺,50pA.N.S.,統(tǒng)計不顯著,配對t檢驗)。鑒于近期涉及TRPV1通道與微管在滲透誘導(dǎo)的細胞收縮過程中的相互NOMPC機械門控中必需。在內(nèi)面向外膜片中,向?qū)C械力刺激的應(yīng)答電流大大降低(圖5E)。在細胞吸附模式中諾考達唑同樣有相似效應(yīng)(5Fand5G)NOMPCNOMPC在質(zhì)膜中的表達水平?jīng)]有影響(圖S5DandS5E)NOMPCKv1.2Kv2.1通道電壓門控無影響(S5F–S5I)。化學(xué)成分NOMPC通道門控有類似的效應(yīng),NOMPC活動無影響(5H),進一步說明微管對NOMPC機械門控至關(guān)重要。相比之下,穩(wěn)定或破壞肌動蛋白細胞骨架對NOMPCKvARARNOMPC轉(zhuǎn)移至其他離子通道是否依然能體現(xiàn)機TRP29AR(M1-S1268fromNOMPC)NOMPCN-末端胞漿域和Kv1.2跨膜(TM)C末端(G160-V499fromKv1.2),構(gòu)建嵌合蛋白(S1268-G160-Kv1.2chimera)(6A)。為檢測此嵌合體通道是否有機械力刺激門控能力,我們對從經(jīng)轉(zhuǎn)染的S2細胞中獲得的外面向外膜片施加Cs+則不能觸發(fā)(6Band6C)NOMPCS1前的連接體對機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)非常重要,因為不含該連接體(M1-M1120fromNOMPC),而NOMPCARKv1.2C末端(G160-V499fromKv1.2)的嵌合體通道(M1120-G160-Kv1.2chimera)不具有機械敏感性(圖6Band6C)。為確證機械敏感性電流實際上來源于S1268-G160-Kv1.2嵌合體,我們檢測了特定Kv1.2通道阻遏劑蝎毒素(MTX),這是一種能阻遏嵌合體通道的機械敏感性電流的毒素(6D)NOMPC的通道活動并無影響(S6AandS6B)。NOMPC錨蛋白重復(fù)序列將機械敏感性賦予KvNOMPCKv1.2Kv2.1構(gòu)建嵌合通道的策略。用黑點強調(diào)界定蛋白質(zhì)片段邊界嵌合體通道S126-G160Kv.2對負壓導(dǎo)致的膜變形顯示機械門控電流,而Cs+溶液中不存在這種現(xiàn)象(灰色軌跡)。而全長Kv1.2(WTKv.2),N末端截短的Kv.(Kv1.ΔNtrmins)和M112-G16-Kv1.2嵌合體均對同一刺激無應(yīng)答。外面向外膜片保持電壓0mV。機械門控電流振幅圖(n2681077.單因素方差分析后進行Tukey???p機械門控電流被蝎毒(MTX)部分阻擋(???p0.001,t檢驗n對負壓引起膜變形顯示機械門控電流,而全長Kv2.1(WTKv2.1)、N末端截短的60mV。Kv1.2沒有表現(xiàn)出機械敏感性(6Band6C),但的跨膜區(qū)域和C末端,構(gòu)建嵌合通道(圖6A),而據(jù)Kv2.1不具有機械敏感性。嵌合通道(S1268-V182-Kv2.1chimera)AR-Kv1.2嵌合通道類似的機械敏感性,而野生型Kv2.1、缺少N-末端胞漿域的Kv2.1(Kv2.1ΔNterminus)和不含連接體而包含NOMPCAR、Kv2.1TM域和C末端的嵌合通道(M1120-G182-Kv2.1chimera)沒有機械敏感性(6Eand6F)。NOMPC振幅(2E7BandS7B)。S1268-G160-Kv1.2嵌合通道產(chǎn)生的機械敏感性電流在持續(xù)壓力刺激的應(yīng)答上呈現(xiàn)出適應(yīng)現(xiàn)象(圖7C)。機械敏感性嵌合通道的生物物當施加壓力增大時(壓力在10mmHg-50mmHg范圍內(nèi)每次增加10mmHg),AR-Kv1.2 的機械門控電流對于壓力的劑量依賴性曲線AR-Kv1.2嵌合通道產(chǎn)生的機械門控電流表現(xiàn)對持續(xù)刺激的適應(yīng)。膜片持續(xù)壓強60mVKv1.2通道、AR-Kv1.2嵌合通道與微管共標記(比例尺,5μm;方框強調(diào)微(FG)Kv1.2(F)AR-Kv1.2嵌合通道(G)的代表性(H)野生型Kv1.2和AR-Kv1.2嵌合通道在存在或不存在機械刺況下的I-V曲線,100mV下標準化至沒有機械刺激的電流(灰色虛線強調(diào)V1/2處的電流-電壓關(guān)系)。膜片保持-80mVn4))(K)WTKv2.1AR-Kv2.1嵌合通道在有或無機械刺激下I-V100mV下標準化至沒有機械刺激的電流(灰色虛線強調(diào)V1/2處的電流-電壓關(guān)系。膜片保持電壓-80mV(WTKv2.1n=4,嵌合通道n=5)。所有誤差線表示±標準誤。又見圖嵌合通道表現(xiàn)出微管的相互作用,這與NOMPC通道類似,且比野生型Kv通道更顯著(圖7EandS7C)。用諾考達唑破壞微管后將大大消除嵌合通道的機械力應(yīng)答(7D),而對于野生型Kv1.2通道則沒有影響(S5FandS5G)AR-Kv1.2嵌合通道產(chǎn)生的機械門控電流同樣依賴于微管的完整性。這些實驗為AR電流,Kv1.2(圖7F–7H)和Kv2.1(7I–7K)經(jīng)過標準化后的電流(I/Imax)電壓相關(guān)性均被左移。通過在每個膜去極化步驟中向AR-Kv嵌合通道的膜片施加50mmHg壓力脈沖,我們對處于接近去極化終點附近平臺期的電流,及去極化I-V曲線,Kv1.27H)Kv2.1(7K)12.1mV28mV,而對于野AR的轉(zhuǎn)移也賦予了含有電壓感受器和Kv1.2或Kv2.1的孔道的嵌合通道機械A(chǔ)RNOMPCMMC的成我們的分析記錄了NOMPCAR將延長MMC,這支持之前關(guān)于AR是不足以加倍其長度。由于測定僅限于二維平面,而的錨蛋白可能更為緊密,電子顯微鏡不能解決這種情況,則長度增

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