錨蛋白重復(fù)序列傳導(dǎo)力 機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通道打WeiZhang,LiE.Cheng,MaikeKitmann,JiefuLi,MajaPetkovic,TongCheng,PengJin,ZhenhaoGuo,MartinC.G?pfert,LilyYehJan,YuhNungJan時感受器電位（TRP）的NOMPC通道是一種作用于果蠅觸覺聽覺感知的假說，認為這些錨蛋白重復(fù)序列作為將力傳導(dǎo)至通道的系繩。本文中，我們N末端的錨蛋白重復(fù)序列形成了一個胞質(zhì)域，其對于體外NOMPC機械力錨蛋白重復(fù)序列將延長將機械力敏感性神經(jīng)元中NOMPC牽引到微管上的絲。除此之外，微管的連接對于NOMPC的機械力門控是必需的。重要的是，所得嵌合體通道同樣呈現(xiàn)出機械力敏感性。這些實驗有力地支持了NOMPC通在將力傳導(dǎo)至通道““過程中共同總用。已有大量支持細菌MscL通道和真核生物鉀離子通道的膜力模型，然而系繩模型的直接分子少之又少。TRP通道中，NOMPCARNOMPC作用于幼蟲運動中至關(guān)重要。NOMPC基本滿足真正機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的所有條件，究。NOMPCAR在機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中作為系繩的可這項研究中，我們測試帶有不同AR刪除或的NOMPC突變體，發(fā)現(xiàn)29AR的完整性對于體外表達系統(tǒng)及體內(nèi)觸覺受體神經(jīng)元中的NOMPC機械門控NOMPC機械敏感性至關(guān)重要。為測定Kv1.2Kv2.1中，使用超過去極化可達到NOMPCNOMPCNAR的作用，我們首先評估了其相對于細胞膜的NOMPC蛋白不同區(qū)域的抗體對細胞進行通透性表位抗體(αNOMPC-EC;圖1A)，該抗體可在非通透條件下識別質(zhì)膜中的(αNOMPC-N-ter1A)C端的抗體(αNOMPC-C-ter1A)均在通透處理TRP通道。錨蛋白重復(fù)序列對于NOMPC膜表達 通道亞基預(yù)測結(jié)構(gòu)的拓撲學(xué)簡圖。洋紅標記表明本使用抗體被識別的位使用孔螺旋（αNOMPC-EC）、NOMPCN末端（αNOMPC-N-ter）和NOMPCC（αNOMPC-C-ter）NOMPC蛋白進行非通透處理的染色（比例尺，10μm）(C)對NOMPC蛋白進行通透處理染色(D–K)分子結(jié)構(gòu)簡圖，表面染色（比例尺，5μm）ARNOMPC0mV（灰色和-60mV（黑色時進行電流（比例尺，10pA）右邊的條形圖呈現(xiàn)表明NOMPC染色的熒光強度（F.intensity）（相對強度，n=2810101125121729。在不同倍數(shù)全長和Δ1-12AR-NOMPC之間進行配對t檢驗，???p<0.001）。全長NOMPC刪除29個AR的NOMPC13-29ARNOMPC16-29ARNOMPC刪除1-12AR的NOMPC將前12個AR與后17兩倍AR重復(fù)的NOMPC17ARNOMPC膜定位正常所有誤差線表示±標準誤也可見圖S1，圖S2和ARNOMPC使用識別NOMPC胞外域的抗體（αNOMPC-EC）對細胞膜上的NOMPC17ARΔ1-12AR的表現(xiàn)類似于N14-18AR的低溫敏TRPA11217ARARΔ13-29AR含有前12個AR)測試AR的兩個區(qū)域是否存在差異。當后17個ARΔ13-29AR-NOMPC)的表面表達量和開放概率(1H,S2A,andS2B)12AR17個NOMPC蛋白折疊，組裝或膜定位是必需的。此外，只有顯示表面表達的突變體和野生型(WT)NOMPC蛋白顯示自發(fā)通道活動(圖ARNOMPCNOMPCAR介導(dǎo)了機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的門控。為檢驗該理論的NOMPC(29+29AR-NOMPC)顯示機械門控(2Aand2B)。盡管對膜片區(qū)域上NOMPC介導(dǎo)的電流ARNOMPC介導(dǎo)的更大(2C,紅條)，然而根據(jù)表面表達水平進行與野生型NOMPC處于同一水平(圖2C,黑條)。相比之下，即使突變體Δ1-12AR-NOMPC29+17AR-NOMPC蛋白都有表面表達和自發(fā)通道活動，用同一壓力使膜變形并不能引起其應(yīng)答(圖2A–2C)。自發(fā)通道活動可能來自物Gd3+阻斷(圖S2C)AR的完整性對于NOMPC通道的機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)是（B）機械門控性電流振幅（絕對值）圖（n=12,11,8,7。單因素方差分析后進行???p12,11,8,7Tukey???p<0.001）(EF)應(yīng)答壓力（E）(n107)及壓電位移（F）(n10687)NOMPC機械門控性電S2細胞并在全細胞結(jié)構(gòu)下記錄應(yīng)答時，可得到類似結(jié)果(2D)。這些機械性門控電流振幅取決于機械力刺激的強度(2Eand2F)。特別地，當不存在機械刺激時，Δ1-12AR-NOMPCNOMPC更有可能開放(圖S2AandS2B)。因此，NOMPC29AR的結(jié)構(gòu)完整性對機械門控至關(guān)重要，其可能通過形成一個螺旋的全幅轉(zhuǎn)彎進行力轉(zhuǎn)導(dǎo)。對NOMPC門控的ARNOMPC果蠅幼蟲體壁第三類多樹突（da）神經(jīng)元感受溫和觸覺，依賴于NOMPC的機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)。nompC無效突變使神經(jīng)元不再產(chǎn)生觸碰激發(fā)的應(yīng)答。為研究NOMPCAR在這些機械力感受神經(jīng)元中所起作用，我們檢測由第三類多樹突神Gal4激活蛋白（19-12-Gal4）ARNOMPC通道29+29AR- 均能被運往樹突的質(zhì)膜。然而，第三類多樹突神經(jīng)元中現(xiàn)象在異源細胞中也被發(fā)現(xiàn)1J)移動體壁20μm象(圖3Band3C)。第三類多樹突神經(jīng)元中野生型NOMPCAR重復(fù)(29+29AR)NOMPC的表達能恢復(fù)突變表型的觸覺激發(fā)應(yīng)答，而29+17AR,Δ1-29AR,或Δ1-12AR的NOMPC則不行3Band3C)29+29AR的的部分修復(fù)可能與較低的表達水平相關(guān)S3AandS3B)。結(jié)合圖二體外實驗29ARNOMPC通道在體內(nèi)機械力感受功能體內(nèi)NOMPC通道功能依賴錨野生型和NOMPC突變體在nompC無效突變體中第三類多樹突神經(jīng)元的表達（比例尺，第三類多樹突神經(jīng)元對機械力刺激的應(yīng)答，揭示全長NOMPC和29+29AR- nompC空白表型的功能恢復(fù)，而其他突變的NOMPC通道ompC無效突變體幼蟲缺失的觸覺應(yīng)答可通過表達全長NOMPC或2+2AR-NOMPC得以恢復(fù)，而通過第三類多樹突神經(jīng)元特異性Gl4（1912-Gl4在第三類多樹突神經(jīng)元中激活其他突變NOMPC通道則不表現(xiàn)這種作用。我們使用非成對t檢驗進行兩組間比較，并進行單因素方差分析及Tkey比較以分析3或4組數(shù)據(jù)。s,無顯著差異。??p<.01,p<.0.所有誤差線表示標準誤。型如下：w1118nompCnompC1/nompC3.(全長NOMPC):nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-NOMPC-GFP.Δ1-29AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-29AR-NOMPC-GFP.Δ1-12AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4/UAS-Δ1-12AR-NOMPC-GFP.29+17AR:nompC1/nompC3;19-12-Gal4,UAS-29+17AR-NOMPC-GFP.NOMPC-介導(dǎo)的幼蟲觸覺依 的表達，可恢復(fù)其觸覺敏感性(3D)Δ1-29AR,Δ1-12AR,或29+17AR的NOMPC通道則不行。AR是膜-狀連接，即膜-微管連接器（MMCs）MMCNOMPCAR則排列可使用電子顯微鏡辨別出4A)，基于對其良好的解剖基礎(chǔ)，我們使用實定位于野生型果蠅（”NOMPC+“），nompC1-無效4A–4CandS4)NOMPC29+29AR-NOMPCMMCs明顯增長（MMC平均長度±標準差：18±5nm[NOMPC29+29AR]，15±5nm154nm[NOMPC29+29AR],124nm[NOMPC+])(4D).AR是膜-微管連接器的重平衡棒鐘形感受器樹突狀尖端的總體結(jié)構(gòu)（比例尺果蠅平衡棒鐘形機械力受體機械敏感性樹突狀尖端的橫截面，描繪了細胞外鞘、細胞膜、微管和膜-微管連接器（MMCs，箭頭）。MMCs在NOMPC+野生型果蠅（左圖）中呈現(xiàn)，但在ompC1無效突變體（NOMP-,中圖）中不再呈現(xiàn)。經(jīng)由NOMPC-GAL4在無效突變體中表達2+2AR-NOMPC，恢復(fù)MMC（NOMP2929A右圖（比例尺，20nmMMCs特寫（上），MMC臨摹圖（底）。對于每一種壓力，呈現(xiàn)小（左）和大（右）微管-膜間距離的樣本（比例尺，20nm。紅線突MMC的結(jié)構(gòu)）。MMCs相連接的微管片段計算而得的NOMPC+NOMPC-,NOMPC29+29AR果MMC的相對豐度。NOMPC29+29ARMMCNOMPC+果蠅中類似(p0.05)，而NOMPCNOMPC果蠅中豐度存在顯著差異(p0.001,Bonferroni校正Mann-WhitneyU-檢驗；分析的鐘形受體數(shù)量:31(NOMPC+),24(NOMPC-),41+)--的膜-???顯著差異p0.001,使用BonferroniMann-WhitneyU-檢驗如此超結(jié)構(gòu)效應(yīng)；據(jù)，NOMPC蛋白的丟失很大程度上并不會改變微管-膜間距離，暗示MMC調(diào)整張力以適應(yīng)預(yù)設(shè)的距離。然而，當我們系統(tǒng)分析NOMPCNOMPC果蠅膜-nompC無效[NOMPC?]，124nm[NOMPC+])(4D)MMC似乎將膜與微管拉29+29AR-NOMPC的果蠅中，微管-NOMPC+和NOMPC?果蠅(圖4D)中發(fā)現(xiàn)的顯著不同，介于二者之間。NOMPC據(jù)，異源表達NOMPC蛋白質(zhì)在培養(yǎng)細胞中也與微管相連。NOMPC表面附近區(qū)域尤為明顯(圖5A)。使用NOMPC抗體(αNOMPC-EC)對非通透性NOMPC通道于微管共定位(5B)。道與膜附近皮層微管相互作用的概念相一致(圖5CandS5A)。S2細胞中NOMPC表達不能改變微管分布(S5B)NOMPC蛋白是否與微管結(jié)微管強烈相互作用(圖5D)，說明NOMPC通道可能與細胞中的微管相結(jié)合。圖5NOMPC通道與微管的連接對于機械門控至關(guān)重要面附近0.35μm中心平面。NOMPCS2NOMPC和微管進行染色（比例尺，5μm）。取蓋片表面附近0.35μm中心平面。TIRF顯微鏡顯示細胞皮層區(qū)域的膜NOMPC和微管間相互作用（比例尺，1μm）NOMPC形成細胞裂解液或微管蛋白親和層析純化物的共沉淀測定 有微管蛋白?MT,無微管蛋白S,上層清液P,顆粒諾考達唑?qū)OMPC機械門控電流阻礙的時程（0-150s間的配對t檢驗，p0.001,n=6）。,t檢驗n6and6)。膜片保持電壓+60mV50mmHg負壓。向生理鹽水中加入諾考達唑(100nMn7)或秋水仙胺(10μMn6)，該電壓降低，加入紫杉醇(10nMn6)卻不變（比例尺，50pA.???p0.001N.S.:統(tǒng)計不顯著，配對t檢驗）(I)+60mV下NOMPC的機械門控電流達到50mmHg負壓，向生理鹽水中加入細胞松弛素D(10nM,n=6)、微絲解聚素A(1μM,n=6)或jaskinolide(100nM,n=7)均無影響（比例尺，50pA.N.S.,統(tǒng)計不顯著，配對t檢驗）。鑒于近期涉及TRPV1通道與微管在滲透誘導(dǎo)的細胞收縮過程中的相互NOMPC機械門控中必需。在內(nèi)面向外膜片中，向?qū)C械力刺激的應(yīng)答電流大大降低(圖5E)。在細胞吸附模式中諾考達唑同樣有相似效應(yīng)(5Fand5G)NOMPCNOMPC在質(zhì)膜中的表達水平?jīng)]有影響(圖S5DandS5E)NOMPCKv1.2Kv2.1通道電壓門控無影響(S5F–S5I)。化學(xué)成分NOMPC通道門控有類似的效應(yīng)，NOMPC活動無影響(5H)，進一步說明微管對NOMPC機械門控至關(guān)重要。相比之下，穩(wěn)定或破壞肌動蛋白細胞骨架對NOMPCKvARARNOMPC轉(zhuǎn)移至其他離子通道是否依然能體現(xiàn)機TRP29AR(M1-S1268fromNOMPC)NOMPCN-末端胞漿域和Kv1.2跨膜（TM）C末端(G160-V499fromKv1.2)，構(gòu)建嵌合蛋白(S1268-G160-Kv1.2chimera)(6A)。為檢測此嵌合體通道是否有機械力刺激門控能力，我們對從經(jīng)轉(zhuǎn)染的S2細胞中獲得的外面向外膜片施加Cs+則不能觸發(fā)(6Band6C)NOMPCS1前的連接體對機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)非常重要，因為不含該連接體(M1-M1120fromNOMPC)，而NOMPCARKv1.2C末端(G160-V499fromKv1.2)的嵌合體通道(M1120-G160-Kv1.2chimera)不具有機械敏感性(圖6Band6C)。為確證機械敏感性電流實際上來源于S1268-G160-Kv1.2嵌合體，我們檢測了特定Kv1.2通道阻遏劑蝎毒素（MTX），這是一種能阻遏嵌合體通道的機械敏感性電流的毒素(6D)NOMPC的通道活動并無影響(S6AandS6B)。NOMPC錨蛋白重復(fù)序列將機械敏感性賦予KvNOMPCKv1.2Kv2.1構(gòu)建嵌合通道的策略。用黑點強調(diào)界定蛋白質(zhì)片段邊界嵌合體通道S126-G160Kv.2對負壓導(dǎo)致的膜變形顯示機械門控電流，而Cs+溶液中不存在這種現(xiàn)象（灰色軌跡）。而全長Kv1.2（WTKv.2），N末端截短的Kv.(Kv1.ΔNtrmins)和M112-G16-Kv1.2嵌合體均對同一刺激無應(yīng)答。外面向外膜片保持電壓0mV。機械門控電流振幅圖(n2681077.單因素方差分析后進行Tukey???p機械門控電流被蝎毒（MTX）部分阻擋（???p0.001,t檢驗n對負壓引起膜變形顯示機械門控電流，而全長Kv2.1(WTKv2.1)、N末端截短的60mV。Kv1.2沒有表現(xiàn)出機械敏感性(6Band6C)，但的跨膜區(qū)域和C末端，構(gòu)建嵌合通道(圖6A)，而據(jù)Kv2.1不具有機械敏感性。嵌合通道(S1268-V182-Kv2.1chimera)AR-Kv1.2嵌合通道類似的機械敏感性，而野生型Kv2.1、缺少N-末端胞漿域的Kv2.1(Kv2.1ΔNterminus)和不含連接體而包含NOMPCAR、Kv2.1TM域和C末端的嵌合通道(M1120-G182-Kv2.1chimera)沒有機械敏感性(6Eand6F)。NOMPC振幅(2E7BandS7B)。S1268-G160-Kv1.2嵌合通道產(chǎn)生的機械敏感性電流在持續(xù)壓力刺激的應(yīng)答上呈現(xiàn)出適應(yīng)現(xiàn)象(圖7C)。機械敏感性嵌合通道的生物物當施加壓力增大時（壓力在10mmHg-50mmHg范圍內(nèi)每次增加10mmHg），AR-Kv1.2 的機械門控電流對于壓力的劑量依賴性曲線AR-Kv1.2嵌合通道產(chǎn)生的機械門控電流表現(xiàn)對持續(xù)刺激的適應(yīng)。膜片持續(xù)壓強60mVKv1.2通道、AR-Kv1.2嵌合通道與微管共標記（比例尺，5μm；方框強調(diào)微(FG)Kv1.2（F）AR-Kv1.2嵌合通道（G）的代表性(H)野生型Kv1.2和AR-Kv1.2嵌合通道在存在或不存在機械刺況下的I-V曲線，100mV下標準化至沒有機械刺激的電流（灰色虛線強調(diào)V1/2處的電流-電壓關(guān)系）。膜片保持-80mVn4))(K)WTKv2.1AR-Kv2.1嵌合通道在有或無機械刺激下I-V100mV下標準化至沒有機械刺激的電流（灰色虛線強調(diào)V1/2處的電流-電壓關(guān)系。膜片保持電壓-80mV(WTKv2.1n=4，嵌合通道n=5)。所有誤差線表示±標準誤。又見圖嵌合通道表現(xiàn)出微管的相互作用，這與NOMPC通道類似，且比野生型Kv通道更顯著(圖7EandS7C)。用諾考達唑破壞微管后將大大消除嵌合通道的機械力應(yīng)答(7D)，而對于野生型Kv1.2通道則沒有影響(S5FandS5G)AR-Kv1.2嵌合通道產(chǎn)生的機械門控電流同樣依賴于微管的完整性。這些實驗為AR電流，Kv1.2(圖7F–7H)和Kv2.1(7I–7K)經(jīng)過標準化后的電流(I/Imax)電壓相關(guān)性均被左移。通過在每個膜去極化步驟中向AR-Kv嵌合通道的膜片施加50mmHg壓力脈沖，我們對處于接近去極化終點附近平臺期的電流，及去極化I-V曲線，Kv1.27H)Kv2.1(7K)12.1mV28mV，而對于野AR的轉(zhuǎn)移也賦予了含有電壓感受器和Kv1.2或Kv2.1的孔道的嵌合通道機械A(chǔ)RNOMPCMMC的成我們的分析記錄了NOMPCAR將延長MMC，這支持之前關(guān)于AR是不足以加倍其長度。由于測定僅限于二維平面，而的錨蛋白可能更為緊密，電子顯微鏡不能解決這種情況，則長度增