ICS65.020.20B16備案號：江DB32蘇省地方標準DBT3487—2018TechnicalSpecificationfortheSeedlingDetectionofCucumberGreenMottlesaicVirus江蘇省質量技術監督局發布IDB32/T3487—2018前言本標準按GB/T1.1—2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構及編寫》的規定編寫。本標準由江蘇省農業科學院提出并歸口。本標準起草單位：江蘇省農業科學院。本標準主要起草人：程兆榜、任春梅、季英華、楊柳、繆倩、周益軍。1DB32/T3487—2018黃瓜綠斑駁花葉病毒苗期檢測技術規程1范圍本標準規定了苗床期瓜苗黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測條件、檢測技術、結果判定和結果記載。本標準適用于苗床期癥狀尚未表現的瓜類作物上黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的的修改單)適用于本文件。GB/T35335黃瓜綠斑駁花葉病毒病監測規范SN/T2964植物病毒檢測規范3檢測條件3.1主要試劑磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鉀(KCl)、氫氧化鈉(NaOH)、碳酸氫二鈉(Na2HCO3)、氯化鈉(NaCl)、疊氮化鈉(NaN3)、PVP-400、雞卵清蛋白、無水亞硫酸鈉(Na2SO3)、吐溫-20、焦碳酸二乙酯(DEPC)、溴百里酚藍、乙二醇、Tris堿、Tris-HCl、硼酸、EDTA、無水乙醇、瓊脂糖、DIGDNALabelingKit、CGMMV抗體。PCR試劑和檢測過程中所需溶液配方，參見附錄A。除另有規定外，所用試劑均為分析純或生化試劑。3.2用具及儀器用具耗材：移液器、一次性手套、牛皮紙袋、標簽紙、記號筆等儀器設備：高壓滅菌鍋、培養箱、高速冷凍離心機(規格：-6℃~20℃、最高轉速12000轉/分以上)、電泳儀(規格：電壓50~120V、電流10~800mA)、PCR儀、凝膠成像系統、超純水儀。4檢測技術4.1采樣方法4.1.1采樣時間待檢材料為嫁接或未嫁接的黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜類作物幼苗，采樣時間為出廠定植前3天~7天植株處于2片~4片真葉期。4.1.2采樣部位植株最上部半展開-展開的心葉，心葉未達要求時取位于心葉下部一張完全展開葉。4.1.3取樣方法五點法取樣，一株為一個樣本，不同品種或同一品種不同時間播種的為不同批次，每批次樣本數量不小于200株或同批次苗的0.1%。樣本采集時使用一次性手套單株采集并臨時保存在一次性手套中。2DB32/T3487—20184.1.4樣品處置取樣后葉片一分為二，一半為檢測樣品、一半為留存樣品。樣品用吸水紙包裹置于透氣牛皮紙袋中，新鮮檢測樣品在4℃下臨時保存3天內檢測完畢，如不能在3天內檢測則將樣品于-20℃的條件下冰凍保存。留存樣品室溫下蔭干-20℃的條件下冰凍保存一年后，確認不再需要時焚燒或深埋處置。4.2檢測方法4.2.1樣品處理稱取0.1g待檢樣品葉片，加入適量液氮充分研磨成粉末后加入10倍體積的通用樣品處理緩沖液(見附錄A)溶解，10000轉/分離心5分鐘，上清即為樣品提取液。同一批樣品中加入具典型斑駁花葉癥狀并經PCR法鑒定確認為CGMMV的病樣稀釋1000倍為陽性對照、經PCR法確認無CGMMV的健康葉片為陰性對照。4.2.2免疫捕獲4.2.2.1用碳酸鹽包被緩沖液(見附錄A)稀釋黃瓜綠斑駁花葉病毒的抗血清500倍，取稀釋后的抗血清30μL包被PCR管，4℃孵育過夜或37℃下放置2h。4.2.2.2棄包被緩沖液，用洗滌緩沖液(見附錄A)洗滌3次~4次，加入50μL樣品提取液，37℃孵育2h。4.2.2.3棄樣品提取液，用洗滌緩沖液洗滌3次~4次，再用無菌去離子水洗一次，吸盡管底余液后直接在包被了病毒的PCR管中進行反轉錄。4.2.3反轉錄4.2.3.1CGMMV特異性引物的設計及合成根據CGMMV分離物(Genbank序列號DQ217778)序列設計一對用于擴增CGMMV-cp基因的特異性引物：F:5′-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3′；R:5′-TGGGCCCCTACCCGGGGAAAAG-3′，-20℃保存。4.2.3.2反轉錄體系及操作在免疫捕獲后的CR管中加入CGMMV3’端引物1μL，DEPC水9μL，65℃變性5min，取出置于冰上5min，再依次加入下列試劑：5×M-MuLV反轉錄酶緩沖液2μL，40mmol/LdNTPs(每種10mmol/L)0.5μL，RNasin(40U/μL)0.5μL，M-MuLV反轉錄酶(20U/μL)Lh活10min，-20℃保存備用。管，參照NY/T2288-2012中7.4的要求進行，并略有改進。具體操作參見附錄B。4.2.4PCR以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板，進行PCR擴增，擴增反應體系25μL。25μLPCR標準反應體系：10×TaqPCRBuffer(WithMg2+)2.5μL，40mmol/LdNTPs(每種10mmol/L)0.5μL，TaqDNAPolymerase(5u/ul)0.5μL，CGMMV上游引物(10μmol/L)0.5μL，CGMMV下游引物(10μmol/L)0.5μL，cDNA3μL和DEPC水17.5μL。72℃延伸10min。上述PCR結束后，每個PCR管中取出1μL加入新PCR管中，采用同樣的25μLPCR標準反應體系和PCR反應程序再次進行PCR擴增。5結果判定7.1電泳檢測配制1%瓊脂糖凝膠，將PCR產物3μL與上樣緩沖液3μL混合加入樣品孔中，100V電泳30分鐘。核酸染料染色15min，凝膠成像系統拍照觀察。3DB32/T3487—20187.2結果判定觀察瓊脂糖凝膠電泳(參見附錄B)結果，陽性對照在660bp處有條帶出現，且陰性對照無條帶出現的前提下，待測樣品在660bp處有條帶出現，即可判定樣品攜帶CGMMV；否則為陰性反應，即樣品不攜帶CGMMV。當樣品檢測為陽性時，按GB/T35335規定執行。8結果記載將實驗室檢測鑒定結果記載于表1(瓜苗攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測結果記錄表)(見附錄B)，記錄保存1年以上。4DB32/T3487—2018附錄A(資料性附錄)試劑及配制方法A.1免疫捕獲緩沖液A.1.1洗滌緩沖液(WashBuffer,0.01MPBST)稱取8gNaCl、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、3gNa2HPO4溶化于800mL無菌去離子水中，再加入0.5mLTween-20定溶于1000mL，即為0.01MPBST，4℃保存。A.1.2通用樣品處理緩沖液(GeneralExtractBuffer)稱取2g雞卵清蛋白，1.3g無水亞硫酸鈉，20gPVP-400和0.2g疊氮化鈉，加入1000mLA.1.1所述0.01MPBST中，再加入10mLTween-20，4℃保存。A.1.3碳酸鹽包被緩沖液(Coatingbuffer,0.5M)A.2RT-PCR試劑A.2.1RT-PCR分子試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、購自大連寶生物公司。反轉錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑購自Promega公司，-70℃保存。A.2.2電泳緩沖液TBE在1000mL去離子水中加入Tris堿54g、硼酸27.5g、20mL0.5MEDTA(pH8.0)，使用時利用去離子水10倍稀釋，即為0.5×TBE。A.2.3瓊脂糖凝膠在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的瓊脂糖，融化，冷卻至60℃倒入插入梳子的制膠槽中，冷卻