實驗六有機酸的測定精第1頁/共21頁檢測技術實驗第2頁/共21頁

實驗六、有機酸的測定（HPLC法）第3頁/共21頁一、實驗目的學習和掌握有機酸樣品的處理和HPLC檢測方法。進一步了解高效液相色譜儀的使用操作性能。掌握標準工作曲線的建立、數據的處理及定量分析。第4頁/共21頁二、原理果蔬及其制品、各種酒類、乳及乳制品中的主要有機酸可用高效液相色譜進行測定。樣品經過處理、離心及超濾，用C-18反相柱和pH2.65的純蒸餾水作流動相，在紫外214nm處定量測定。本法可同時測定檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸及延胡索酸等7種有機酸。第5頁/共21頁三、材料與儀器材料：果蔬、橘汁、酒等。儀器：高效液相色譜儀（Agilent1100)、分析天平、組織搗碎機、研缽、三角瓶、水浴、離心機、0.45um濾膜、溶劑過濾器、樣品過濾器等。第6頁/共21頁四、試劑磷酸（AR）流動相的制備：用磷酸調節新配制的重蒸水pH至2.65,置超聲波振蕩儀上排氣后用0.45um膜過濾，待用。第7頁/共21頁有機酸標準母液配制：分別稱取蘋果酸10mg，檸檬酸10mg、酒石酸5mg，琥珀酸20mg，延胡索酸10mg，吸取乳酸10ul，冰乙酸10ul，置100ml棕色容量瓶中，以pH2.65重蒸水溶解并定容，使有機酸的濃度分別為100,100,50,200,100,100和100mg/kg.

（本實驗只配蘋果酸10mg，檸檬酸10mg、酒石酸5mg定容到100ml為母液）第8頁/共21頁7種有機酸標準混合液，吸取各有機酸10ml定容到100ml，即可作工作液。（本實驗只配MA、CA、TA三種標準混合液）第9頁/共21頁五、操作步驟第10頁/共21頁（一）樣品制備稱取水果(蘋果）200g左右，洗凈、切碎，用組織搗碎機勻漿，稱樣品10g，置三角瓶中，加入pH2.65

重蒸水60－70ml，沸水浴中加熱60min以浸提有機酸，冷卻，用pH2.65重蒸水移入100ml容量瓶中，定容，過濾，再用0.45um微孔濾膜過濾，待上機測定。第11頁/共21頁（二）色譜條件色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠填料Octadecylsilyl，簡稱ODS）C-18(150*3.9mm,walers)流動相：pH2.65重蒸水（用磷酸調制）流速：0.4ml/min檢測器：UV214nm柱溫：18~20度進樣量：20ul第12頁/共21頁（三）標準曲線的制作取有機酸標準母液(蘋果酸）用倍比稀釋法稀釋成100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5ug/ml,6.25ug/ml,3.125ug/ml濃度，進樣量為20ul,進行分離，并以各種有機酸的濃度對峰高（或峰面積）分別制成標準曲線。在標準曲線的線性范圍內進行樣品中各種有機酸含量的測定。第13頁/共21頁（四）樣品測定：取樣品處理液20ul進行色譜分析，以標準色譜圖進行對照，根據保留時間確定樣品中的各種有機酸。第14頁/共21頁第15頁/共21頁六、計算按下列公式計算樣品中各種有機酸的含量（C）C=N*(H/Hm)*F.50.(V/W).(1000/1000)式中：C—各種有機酸的含量，以mg/kg(L)表示N—20ul有機酸含量ug/20ulH—樣品中某種有機酸的峰高(mm)Hm—標準溶液中某種有機酸的峰高（mm)F—稀釋倍數

V—樣品的定容體積（100ml)W—樣品的稱取量（g或ml)第16頁/共21頁本實驗用樣品洗脫曲線的峰面積查標準曲線計算結果。注意單位換算。第17頁/共21頁七、注意事項本方法的回收率試驗表明，除易揮發的乙酸外，其它有機酸的回收率都較理想。實驗中可用已知濃度的蘋果酸25ug/ml,進樣20ul計算樣品回收率。上機之前對各樣品及標樣用0.45um膜過濾2ml左右，并用剩余的樣品測pH值,pH小于2.5不能上機。手動進樣時必需用力均勻，水平注入，避免進樣引起誤差。第18頁/共21頁八、實驗報告要求預習報告：根據查閱有機酸測定文獻資料及教材寫出預習報告。實驗報告：1、各濃度標準蘋果酸洗脫圖2、樣品洗脫圖。（要求編輯成WORD文檔打印）3、繪制標準工作曲線（在EXCEL中進行打印）。4、結果計算報告第19頁/共21頁實驗分組安排全班以2人/組為單位，進行提取樣品一份供檢測，約1小時左右。液相系統條件設定平衡1小時左右100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5u