實驗三通課的學(xué)習(xí)教案第1頁/共44頁一、物理因素對細(xì)菌的影響1.高壓蒸汽滅菌法2.紫外線對細(xì)菌的影響第2頁/共44頁1.高壓蒸汽滅菌法完全殺滅細(xì)菌的繁殖體和芽胞壓力：103.4KPa溫度:121.3℃時間：15-20min（43頁）第3頁/共44頁使用方法：①加水至鍋內(nèi)達規(guī)定的水平面，放入欲滅菌物品，以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺旋，使鍋蓋均勻密閉。②用電爐加熱，同時打開排氣閥門，使冷空氣逸出。待冷空氣全部排出后，關(guān)閉排氣閥。③繼續(xù)加熱注視壓力表，器內(nèi)壓力又逐漸升高，直到壓力表指在所需數(shù)字即調(diào)節(jié)熱源，維持15～20min．④停止加熱，待壓力自行下降至零時方可徐徐開放排氣閥，排盡余氣，打開鍋蓋，取出滅菌物品。第4頁/共44頁全自動高壓蒸汽滅菌鍋第5頁/共44頁注意事項：鍋內(nèi)物品不宜過緊。注意排出冷氣，否則氣壓表雖已達15磅，溫度達不到121.3℃，不能保證滅菌效果。滅菌后排氣不能過急，以免容器內(nèi)液體外溢或引起破裂。不耐高熱高壓之物品，不能用此法。第6頁/共44頁紫外線殺菌作用強，而穿透能力弱。紫外線中波長265-266nm的殺菌作用最強。殺菌機制：引起DNA鏈上相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。2.紫外線對細(xì)菌的影響第7頁/共44頁

方法:（每個實驗室4個培養(yǎng)皿）

取一個平皿，用密涂法將細(xì)菌涂布于培養(yǎng)皿中，取一無菌濾紙片將平皿部分遮蓋（或打開一半平皿蓋），置于紫外燈下照射30分鐘，將紙片拿開，然后蓋好平皿，37℃倒置培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。濾紙片用后需要用火燒掉第8頁/共44頁密涂接種

分三次接種，每次取一環(huán)。第一次密涂接種后旋轉(zhuǎn)60度二次密涂接種，然后同方向旋轉(zhuǎn)60度后再次密涂接種。第9頁/共44頁二、腸道致病菌的鑒定第10頁/共44頁病原菌的檢驗程序增菌培養(yǎng)革蘭染色分離培養(yǎng)接種瓊脂斜面純培養(yǎng)采集標(biāo)本生化試驗血清學(xué)試驗動物試驗分析鑒定革蘭染色觀察菌落特征第11頁/共44頁一、糖發(fā)酵試驗[原理]

根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。第12頁/共44頁1、確定細(xì)菌是否生長。2、產(chǎn)酸，則培養(yǎng)基指示劑（溴甲酚紫）變?yōu)辄S色，以“+”

表示。3、產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基除變黃外，在倒置的小管中有氣泡，用“

”表示。4、不發(fā)酵糖類，培養(yǎng)基仍為紫色，小管內(nèi)無氣泡，以“-”表示。[結(jié)果][方法]

取糖發(fā)酵管培養(yǎng)基，此時培養(yǎng)基應(yīng)呈澄清、紫色，倒立小管內(nèi)無氣泡，接種細(xì)菌后置37℃溫箱培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果。第13頁/共44頁

大腸桿菌

傷寒桿菌

副傷寒桿菌葡萄糖+乳糖--

糖發(fā)酵實驗第14頁/共44頁二、硫化氫產(chǎn)生試驗

[原理]

某些細(xì)菌能分解蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，生成硫化氫。硫化氫遇培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。[方法]

分別穿刺接種大腸桿菌、變形桿菌至兩管醋酸鉛培養(yǎng)基中。37℃孵育24小時后觀察結(jié)果。第15頁/共44頁[結(jié)果]

沿穿刺線部位呈黑褐色，表明有硫化氫產(chǎn)生，為陽性以“+”表示。不變色者為陰性，以“-”表示。大腸桿菌：-

變形桿菌：+第16頁/共44頁雙糖鐵培養(yǎng)基乳糖和葡萄糖:產(chǎn)酸或產(chǎn)氣。硫酸亞鐵:如細(xì)菌分解含硫氨基酸生成硫化氫,可形成黑色沉淀。酚紅指示劑:酸:黃堿:紅第17頁/共44頁雙糖鐵培養(yǎng)基的用途用于觀察細(xì)菌對葡萄糖及乳糖的發(fā)酵能力（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）。用于觀察細(xì)菌是否產(chǎn)生硫化氫。第18頁/共44頁大腸桿菌發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（糖發(fā)酵試驗）,斜面及低層均呈黃色并有氣泡。沙門菌和志賀菌只發(fā)酵葡萄糖,不發(fā)酵乳糖,分解葡萄糖產(chǎn)的酸使培養(yǎng)基PH下降,酚紅指示劑變黃,但是培養(yǎng)基中的葡萄糖僅有0.1%,斜面的酸性物質(zhì)被氧化成揮發(fā)性酸,且細(xì)菌氧化氨基酸物質(zhì)產(chǎn)生的氨的中和作用,斜面變紅,而底層則為黃色。細(xì)菌分解含硫氨基酸生成的硫化氫可以和FeSO4反應(yīng)生成FeS黑色沉淀。雙糖鐵培養(yǎng)基的特性第19頁/共44頁雙糖鐵培養(yǎng)基上細(xì)菌的生長現(xiàn)象大腸桿菌黃色有氣泡傷寒桿菌上紅下黃中間有黑色沉淀痢疾桿菌上紅下黃第20頁/共44頁Doublesugerironslant第21頁/共44頁1.標(biāo)本的采集

糞便標(biāo)本

SS培養(yǎng)基2.分離培養(yǎng)

觀察菌落特點

革蘭染色(形態(tài)學(xué)鑒定)SS平板接種雙糖鐵培養(yǎng)基（生化反應(yīng)）

玻片凝集試驗（血清學(xué)鑒定）

腸道桿菌的鑒定程序第22頁/共44頁一、觀察上次實驗內(nèi)容在SS平板上可看到散在分布的大小不同、顏色不同的菌落。一種是較大的紅色菌落。一種是較小的無色半透明的菌落，中間有黑色沉淀。第23頁/共44頁方法：穿刺+斜面

接種針挑取單個菌落，沿培養(yǎng)基中心垂直插入至距離管底0.5cm處，原路退出。接種環(huán)挑取單個菌落，自斜面底部向上劃一直線，然后再從斜面底部向上輕輕來回作蜿蜒劃線。培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果并分析。注意：1.應(yīng)在菌落稀疏部位挑取單個菌落。

2.穿刺和斜面接種原則上應(yīng)為同一個菌落。

3.不同的小組可以選擇不同顏色的菌落來接種。二、雙糖鐵培養(yǎng)基的接種第24頁/共44頁三、玻片凝集試驗

原理：

顆粒性抗原(未知細(xì)菌)+抗體(已知)

凝集(+)未凝集(-)材料：沙門菌屬多價O血清

SS平板上菌落第25頁/共44頁方法：

1.取清潔玻片一張，用記號筆劃分成兩部分。用加樣器分別在兩邊加沙門菌屬多價O血清7微升。

2.無菌操作下用接種環(huán)挑取SS平板上菌落（黑色菌落，粉紅色大菌落）與血清混合研磨成均勻乳狀。

3.輕輕搖動玻片，經(jīng)1～2min后觀察結(jié)果。

傷寒血清+待測菌傷寒血清+待測菌結(jié)果:凝集+；無凝集-第26頁/共44頁

注意事項：注意涂菌時，需要標(biāo)明菌落，以免混淆導(dǎo)致錯誤判斷。搖動玻片時要小心，不要使液體流到手上。實驗結(jié)束將玻片放入玻片缸內(nèi)，切勿任意放置或沖洗。第27頁/共44頁四、挑取可疑菌落進行革蘭染色每組同學(xué)各選取一個大小和顏色不同的菌落每人一張玻片第28頁/共44頁五、結(jié)果判斷

SS平板：菌落的形態(tài)、大小、顏色；革蘭染色：形態(tài)，排列，染色特點；雙糖鐵培養(yǎng)基上生化反應(yīng)特點；玻片凝集試驗結(jié)果。第29頁/共44頁操作內(nèi)容1.觀察菌落特征（SS平板）。2.將可疑菌落接種于雙糖鐵培養(yǎng)基上（穿刺+斜面），37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。1支/臺3.玻片凝集試驗。1片/人4.取可疑菌落做革蘭染色。1片/人注意：按照上面的順序依次進行實驗。第30頁/共44頁藥敏試驗第31頁/共44頁目的：1.掌握：紙片擴散法藥敏試驗的原理及結(jié)果判定；2.了解：藥敏試驗的操作方法和意義。第32頁/共44頁原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度。第33頁/共44頁

主要材料：1.普通瓊脂平板2.含抗生素的濾紙片：

青霉素氯霉素鏈霉素慶大霉素第34頁/共44頁方法：標(biāo)記分區(qū)密涂接種貼片培養(yǎng)結(jié)果觀察第35頁/共44頁1.標(biāo)記分區(qū)底部觀第36頁/共44頁2.密涂接種

分三次接種，每次取一環(huán)。第一次密涂接種后旋轉(zhuǎn)60度二次密涂接種，然后同方向旋轉(zhuǎn)60度后再次密涂接種。頂部觀第37頁/共44頁3.貼片頂部觀第38頁/共44頁4.培養(yǎng)

37℃溫箱，倒置培養(yǎng)18-24h。第39頁/共44頁青霉素鏈霉素慶大霉素氯霉素

5.結(jié)果抑菌圈直徑抑菌圈第40頁/共44頁6.注意事項接種時均勻密涂。貼片時，用無菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片使之與培養(yǎng)基充分接觸。鑷取藥物紙片時一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。第41頁/共44頁