實驗一蛋白質含量測定第1頁/共27頁1掌握紫外吸收法、Folin－酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍染色法（Bradford法）測定蛋白質含量的原理和方法

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掌握分光光度計的原理和使用方法實驗目的第2頁/共27頁①有多少樣品可供分析;②蛋白質樣品濃度大約是多少;③樣品中含有哪些可能影響定量的化學物質；④所選方法是否簡單、可靠；⑤含量測定的專一性要求是否很高。選擇合適的蛋白質含量測定方法主要基于幾點考慮：第3頁/共27頁常用的方法物理性質：紫外吸收法化學性質：Folin－酚試劑法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninicacid法），凱氏定氮法，雙縮脲法（Biuret法），膠體金測定法，等等染色性質：考馬斯亮藍染色法（Bradford法）、銀染法測定絕對含量應用凱氏定氮法（蛋白質的含氮量為16％）。第4頁/共27頁蛋白質在紫外光區（190nm-360nm）有兩個強烈吸收峰：280nm和190nm。280nm有吸收的電子所需能量較少，因為這些光子存在于芳香環的共軛雙鍵中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香環，可吸收280nm波長的光子，苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白質的吸收強度與上述幾種氨基酸的含量有關，因此相同濃度的不同種類蛋白質，其280nm的吸收值差別很大(圖1)。紫外吸收法第5頁/共27頁圖1.蛋白質和核酸的紫外吸收光譜圖A是15μg/ml蛋白的吸收光譜。圖A中插圖是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明膠(G)的吸收光譜，緩沖液為：0.01%Brij35,0.1MK2SO4,5mMKH2PO4,pH7。圖B是10μg/mlRNA和DNA的吸收光譜。第6頁/共27頁肽鍵在190nm有強吸收峰。一般分光光度計在190nm的光強較弱，且O2在此波長有吸收，因此通常使用205nm或210nm波長，Trp,Phe,Tyr,His,Cys,Met,andArg的側鏈在此波長有吸收。優點：靈敏，較穩定。缺點:干擾因素多。許多化學物質特別是含C＝C雙鍵和C＝O雙鍵的物質在此波長范圍有吸收，所以必須嚴格控制反應條件。紫外吸收法第7頁/共27頁優點：不需添加任何試劑，因而對樣品沒有任何破壞；測量極其簡單迅速；蛋白濃度和吸光度是線性關系，容易計算。適合測試純度較高、成分相對單一的蛋白質。

紫外吸收法第8頁/共27頁缺點：干擾測定的影響因素多，尤其是RNA和DNA在此波長均有強吸收,所以一定要考慮樣品中是否有核酸.要得到準確可靠的結果，必須嚴格控制樣品溶液的pH和化學組成，使待測樣品和標準樣品的實驗條件一致。敏感度低，要求樣品的濃度較高，量較大。用標準曲線法測定蛋白質含量時，對于那些與標準蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，誤差較大。

紫外吸收法第9頁/共27頁管號01234567標準蛋白溶液（ml）01.01.52.02.53.04.00雙蒸水（ml）4.03.02.52.01.51.000蛋白質含量(mg/ml)00.250.3750.50.6250.751.0

未知蛋白溶液（ml）-------4.0A280

操作步驟紫外吸收法第10頁/共27頁考馬斯亮藍染色法（Bradford法）原理：該方法由Bradford于1976年建立。在酸性條件下，考馬斯亮藍與蛋白質結合后最大光吸收波長由465nm（紅色）轉移為595nm（藍色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His,Lys,Tyr,Trp和Phe也有作用。2－5min呈最大光吸收，至少可穩定1小時第11頁/共27頁簡便,迅速，靈敏度較高。只需要一種反應試劑影響因素較少。去污劑和兩性物質對測定有干擾小于3000Da

的多肽無法測定蛋白濃度高時非線性配制的染色液需過濾除去未溶解的考馬斯亮藍G250考馬斯亮藍染色法（Bradford法）第12頁/共27頁實驗操作步驟

室溫放置5分鐘后測595nm的光吸。考馬斯亮藍染料極易吸附于比色皿壁，每次測量后應用乙醇洗滌后，用雙蒸水清洗。注意混勻，但不要劇烈震蕩。

考馬斯亮藍染色法（Bradford法）第13頁/共27頁原理：Folin-酚試劑法的顯色試劑由試劑甲和試劑乙組成。試劑甲中的Cu2+堿性條件下與肽鍵形成絡合物并被還原成Cu+。Cu+以及蛋白質中的Tyr等的側鏈基團與試劑乙反應，試劑乙中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的Tyr和Phe殘基還原，產生藍色化合物（鉬蘭和鎢蘭的混合物），顯色反應在30分鐘內接近極限。顏色深淺與蛋白含量成正比，可在640nm下測光吸收。

Folin-酚試劑法（Lowry法）第14頁/共27頁酸、銅離子螯合劑（如EDTA、檸檬酸等）、還原劑（如巰基乙醇、DTT、苯酚等）干擾本反應。不同蛋白質主要因其所含的Tyr含量不同而呈現不同的吸收強度。進行測定時，加試劑乙時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當試劑乙加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。費時較長，試劑配制較繁瑣。Folin-酚試劑法（Lowry法）第15頁/共27頁實驗步驟

01234567標準蛋白（1mg/ml）ul02040801201602000待測樣品ul-------200蒸餾水ul1000980960920880840800800Folin-酚試劑甲ml44444444混勻，于室溫放置10分鐘Folin-酚試劑乙ul250250250250250250250250迅速混勻，30℃水浴保溫30分鐘A640Folin-酚試劑法（Lowry法）第16頁/共27頁試劑、實驗材料：

（已放在每個試驗臺的架子上）

標準蛋白溶液：1mg/mlBSA未知蛋白溶液考馬斯亮藍染色液Folin-酚試劑甲Folin-酚試劑乙第17頁/共27頁Lowry法的改進法。堿性條件下，蛋白分子中的肽鍵與Cu2+形成絡合物，并將Cu2+還原成Cu+；Cu+與BCA結合成紫色復合物，在562nm處吸收值與濃度呈正比BCA法第18頁/共27頁與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩定，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/ml），應用更加靈活。可耐受高達5%的表面活性劑測定不同蛋白樣品時比bradford測定法結果均一BCA法第19頁/共27頁常用的測定蛋白質含量方法的比較方法測定范圍（μg/ml）不同種類蛋白的差異最大吸收波長(nm)特點凱氏定氮法小標準方法，準確，操作麻煩，費時，靈敏度低，適用于標準的測定紫外吸收法100—1000大280205靈敏度稍低，快速，不消耗樣品，核酸類物質有影響雙縮脲法1000—10000小540重復性、線性關系好，靈敏度低，測定范圍窄，樣品需要量大Folin-酚試劑法20—500大500-750靈敏，費時較長，干擾物質多考馬氏亮藍G-25050—500大595靈敏度高，穩定，誤差較大，顏色會轉移BCA20—2000大562靈敏度高，穩定，干擾因素少，費時較長第20頁/共27頁1、由于各種方法測定原理不同，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度可能會有較大差異。2、即使是用同一種比色法測定同一樣品，選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。3、所有的樣品（包括標準樣品），都必須在規定時間內測試。時間過長，得到的吸光值會有變化，導致測出的樣品濃度與實際的濃度不符。注意第21頁/共27頁722型光柵分光光度計光源單色器樣品池光電源件讀數單元測量完畢，請把光度計的蓋打開！講解完畢后，每個組出一個同學去127聽老師講解儀器使用。第22頁/共27頁TU1800紫外可見分光光度計波長范圍：200－1100nm測光系統：單光束功能指標：光度測量光譜掃描定量測量鎢燈：340－1100nm氘燈：200－340nm第23頁/共27頁1測紫外吸收要用石英比色皿！2定量實驗取液要準確。3從低濃度到高濃度依次測量，比色皿不要潤洗。因此3ml溶液足夠測定。4測量完畢，請把光度計的蓋打開！5每次實驗時提交上一次的實驗報告。注意事項第24頁/共27頁實驗報告原始數據需老師簽字，附在實驗報告上。真實記錄實驗數據，以標準蛋白含量為橫坐標，相應的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，并標出未知溶液的蛋白含量。可以進行各種軟件繪圖。單位、標示要清楚第25頁/共27頁