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實驗一十七同功酶遺傳標記分析第1頁/共15頁實驗一十七同功酶遺傳標記分析第2頁/共15頁一、實驗目的1.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離同工酶的技術，了解同工酶分析在遺傳學研究中的意義2.同工酶遺傳標記的分析第3頁/共15頁二、實驗原理同工酶是一類由具有不同分子結構和大小但具有相同催化功能的酶。同工酶分子的多種形式是由基因決定的，也即同工酶是基因表達的直接產物。由同一基因座的不同等位基因編碼的各種同工酶又稱為等位酶，它們從分子水平上反映了等位基因的相對差異。因此，同工酶不僅是一種生理生化指標，而且也是一種可靠的遺傳標記。制備丙烯酰胺凝膠時其凝膠的孔徑由凝膠濃度（100毫升凝膠溶液中含有單體和交聯劑總克數）決定。當采用垂直平板不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳體系時，一般上層是大孔徑的濃縮膠（pH6.8），下層為小孔徑的分離膠（pH8.9），電泳緩沖液為Tris－甘氨酸緩沖液（pH8.3）。在這種不連續系統里，存在著電荷效應，分子篩效應和濃縮效應。蛋白質（酶）按其電荷效應和分子篩效應而被分離在凝膠的不同位置上。用此凝膠板與酶反應底物進行催化反應，再用生物染料染色便形成肉眼可見各種酶帶。第4頁/共15頁三、實驗材料

水稻（Oryza

Sativa）：二親本、

F1、F2四種植株群體的幼苗

第5頁/共15頁四、實驗器具和藥品

1.用具：電泳儀，電泳槽，注射筒及針頭，微量注射器，玻璃板，離心機等。2.藥品：三羥甲基氨基甲烷（Tris）,四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉雙丙烯酰胺（Bis），甘氨酸，過硫酸銨，蔗糖，溴酚藍，聯苯胺，過氧化氫。

第6頁/共15頁四、實驗步驟

第7頁/共15頁1.種子發芽

取各樣品種子100粒，分別置于培養皿內，在30℃之恒溫箱中催芽，待芽長出1-2葉，便可進行取樣。

第8頁/共15頁2.制備酶粗提液

一般取樣0.5克，置于研缽中，加入1.5mL電極液研磨勻漿后，將樣品移至小離心管中離心（3500rpm）15分鐘，取上清液，電泳前可在冰箱中保存。

第9頁/共15頁3.聚丙烯酰胺凝膠系統的配制

分離膠的配制濃縮膠的配制第10頁/共15頁4.點樣

取出樣品解凍,以微量注射器吸取樣品上清液50微升加入樣槽內(注意要針頭接近槽底慢慢注入,防止擴散),并在玻璃板上貼上樣品編號。

第11頁/共15頁5.電泳

電泳槽加電極緩沖液，加一滴0.2%溴酚藍，接好電源，在4℃冰箱中電泳。當溴酚藍遷至凝膠下端0.5-1cm時停止電泳，電泳時間約3-4小時。第12頁/共15頁6.染色

將完整的膠板，加入染色液，浸泡凝膠，室溫下染色20-30分鐘，呈現酶帶后取出凝膠，用水漂洗終止染色,洗凈后可仍浸于清水內(注意經常換水),亦可制成干片永久保存。

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