關于動物細胞表達制備藥用蛋白第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日思考要制備出我們想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日

生產用動物細胞的要求和獲得常用生產用動物細胞的特性基因工程細胞構建和篩選第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日

生產用動物細胞的要求和獲得（1）原代細胞是直接取自動物組織器官,經過消化分離而獲得。用量大，浪費時間。常用的有：雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞等。NO.1第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日（2）二倍體細胞系原代細胞經過傳代篩選克隆，挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。二倍體細胞有正常細胞的特點：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養50代；④無致瘤性。第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日（3）轉化細胞系常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。自發人工誘變第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日常用生產用動物細胞的特性

W1-38：正常胚肺組織人二倍體細胞系。核型為2n=46。成纖維細胞，能產生膠原，培養基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,

倍增時間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。NO.2第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。核型為2n=46。屬成纖維細胞。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于生產疫苗。第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細胞,核型為2n=44;培養基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現已用于工程細胞構建。第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細胞，核型2n=60；培養基為199培養基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質炎、狂犬病毒。第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日基因工程細胞構建和篩選NO.3真核細胞基因表達載體的構建使用的載體有兩類：1）病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒2）質粒載體第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日

1）病毒載體牛痘病毒：用構建多價疫苗腺病毒、逆轉錄病毒：用于基因治療。

桿狀病毒：用于外源基因表達。第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日2）質粒載體在細菌和哺乳動物細胞體內都能擴增。都含有如下基本成分：①允許載體在細菌體內擴增的質粒序列。②含有使基因表達的調控元件。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數的擴增系統。第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日1）基因載體的導入基因載體導入動物細胞最常用方法是：

磷酸鈣沉淀法電穿孔法

第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導入。第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細胞膜出現瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉化率較高，拷貝數低。第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日真核生物細胞生產藥用蛋白優點：①具有準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構,理化特性最接近于天然蛋白分子；②具有產物胞外分泌功能，便于下游產物分離純化；③具有重組基因的高效擴增和表達能力；④具有貼壁生長特性，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可以進行懸浮培養，表達水平較高；⑤CHO（注射用重組人促紅素

）細胞屬于成纖維細胞，很少分泌自身的內源蛋白，利于外源蛋白的分離。因此，可以針對性的篩選細胞株第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日

由于CHO-dhfr-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養液中才能得以存活。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲喋呤(methotrexate,MTX)所抑制,用含有目的基因及與之相連的DHFR基因的重組質粒轉化CHOdhfr細胞,利用濃度不斷提高的MTX選擇抗MTX的細胞系,其中DHFR基因及與之相連的目的基因一起擴增,從而使目的基因高水平表達。主要采用DHFR系統和GS系統

2）高效表達工程細胞株的篩選二氫葉酸還原酶系統DHFR第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日DHFR擴增僅僅發生在二個等位基因中的一個。在穩定系中擴增的基因得以保持，因為它們位于染色體上DHFR基因座上（均勻染色區），而其等位基仍保持正常的單拷貝。而在不穩定系中當選擇壓力消除時，擴增的基因至少會部分丟失，但未丟失的是以染色體外的方式（雙微體）存在。第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日每個雙微體帶有2-4DHFR基因，雙微體可以復制，但它們沒有著絲粒，結果它們不能附著在有絲分裂的紡錘絲上，因此不能均等分離進入子細胞，是染色體外的微小染色體。第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期日谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量時,利用細胞內的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺,在缺乏細胞外谷氨酰胺的培養條件下,加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亞砜(methioninesulphoximine,MSX),可使GS基因及與之相連的目的基因擴增,達到提高目的基因表達水平的目的。由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉染過程中不必使用GS缺陷型的受體細胞，而且在正常MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉染細胞，這是GS-MSX系統比DHFR-MTX系統優越之處。主要哺乳細胞株為N