臨床微生物學與檢驗第1頁/共54頁2023/3/142本章內容第一節標本的采集和處理原則第二節細菌的形態學檢查第三節細菌的分離培養和鑒定第四節細菌的非培養檢測方法第2頁/共54頁2023/3/143第一節標本的采集和處理原則一、標本采集的一般原則1．早期采集2．無菌采集3．根據目的菌的特性用不同的方法采集4．采集適量標本5．安全采集

第3頁/共54頁2023/3/144第一節標本的采集和處理原則二、標本的處理1.對環境敏感的細菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌等應保溫并立即送檢2.其他所有的標本采集后最好在2h之內送到實驗室3.若不能及時送檢，標本應置于一定環境中保存4.一般情況下，用于細菌培養的標本保存時間不應超過24h第4頁/共54頁2023/3/145５.病人標本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護６.標本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出７.對于烈性傳染病標本運送時更要特別嚴格，必須按規定包裝，由專人運送８.厭氧性標本應放在專門的運送瓶或試管內運送，有時可直接用抽取標本的注射器運送第5頁/共54頁2023/3/146第二節細菌的形態學檢查1.包括不染色標本檢查法和染色標本檢查法2.鏡檢可以了解有無細菌及大致的菌量3.根據細菌形態、結構和染色性有助于對病原菌的初步識別和分類4.通過形態學檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義第6頁/共54頁2023/3/147第二節細菌的形態學檢查一、不染色標本1.細菌不經染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態下細菌的動力及運動狀況2.常用的方法有壓滴法和懸滴法有動力：可看到細菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移無動力：細菌呈現布朗運動，只在原地顫動而無位置的改變第7頁/共54頁2023/3/148第二節細菌的形態學檢查3.有些病原菌通過不染色標本的動力檢查可作出初步鑒定如疑似霍亂患者，鏡下觀察到來回穿梭似流星狀運動的細菌，制動試驗陽性，可初步推斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。第8頁/共54頁2023/3/149第二節細菌的形態學檢查二、染色標本（一）常用染料1．堿性染料：堿性復紅、結晶紫、美藍等2．酸性染料：有伊紅、剛果紅等3．復合染料（中性染料）及熒光染料：復合染料有瑞氏染料（伊紅美藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料有熒光標記的抗體

第9頁/共54頁2023/3/1410第二節細菌的形態學檢查（二）常用的染色方法1．革蘭染色（gramstain）革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌第10頁/共54頁2023/3/1411第二節細菌的形態學檢查2．抗酸染色（acid-faststain）可將細菌分為兩大類：即-抗酸性細菌

-非抗酸性細菌第11頁/共54頁2023/3/1412第二節細菌的形態學檢查3．熒光染色（1）熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。（2）主要用于結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。第12頁/共54頁2023/3/1413第二節細菌的形態學檢查4.鞭毛染色可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數量，在細菌鑒定中，特別是非發酵菌的鑒定中很重要。5.異染顆粒染色用于白喉棒狀桿菌染色。第13頁/共54頁2023/3/1414第二節細菌的形態學檢查6.芽胞染色：綠色部分為芽胞第14頁/共54頁2023/3/1415第二節細菌的形態學檢查7.墨汁染色:

一般用于新型隱球菌檢查第15頁/共54頁2023/3/1416第三節細菌的分離培養和鑒定一、培養基的種類和選擇培養基的組成成分、培養基種類、培養基的選擇二、分離及培養細菌的分離、細菌培養方法三、生化反應和鑒定碳水化合物的代謝試驗蛋白質和氨基酸的代謝試驗碳源和氮源利用試驗第16頁/共54頁2023/3/1417第三節細菌的分離培養和鑒定一、培養基的種類和選擇培養基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養物制品。

第17頁/共54頁2023/3/1418第三節細菌的分離培養和鑒定(一)培養基的組成成分1．營養物質蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、無機鹽類、雞蛋和動物血清生長因子2．凝固物質瓊脂、明膠、卵白3．抑制劑和指示劑第18頁/共54頁2023/3/1419第三節細菌的分離培養和鑒定（二）培養基種類1．基礎培養基（basedmedium）2．營養培養基（nutrientmedium）3．鑒別培養基（diferentialmedium）4．選擇培養基（selectivemedium）5．特殊培養基（specialmedium）第19頁/共54頁2023/3/1420第三節細菌的分離培養和鑒定1．基礎培養基含有基礎生長所需的基本營養成分，最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。第20頁/共54頁2023/3/1421第三節細菌的分離培養和鑒定2．營養培養基（nutrientmedium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等第21頁/共54頁2023/3/1422第三節細菌的分離培養和鑒定

3．鑒別培養基（diferentialmedium）糖發酵管、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅-鎂藍瓊脂和動力-吲哚-尿素（MIU）培養基等。第22頁/共54頁2023/3/1423第三節細菌的分離培養和鑒定4．選擇培（selectivemedium）

SS瓊脂使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到第23頁/共54頁2023/3/1424第三節細菌的分離培養和鑒定5．特殊培養基（specialmedium）皰肉培養基、巰基乙醇酸納培養基第24頁/共54頁2023/3/1425第三節細菌的分離培養和鑒定（三）培養基的選擇根據標本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養基。伊紅美藍/麥康凱用于篩選革蘭陰性桿菌。第25頁/共54頁2023/3/1426第三節細菌的分離培養和鑒定（三）培養基的選擇從血液、骨髓中分離病原菌用血液增菌培養基第26頁/共54頁2023/3/1427第三節細菌的分離培養和鑒定1．平板劃線分離法2．斜面接種法3．液體接種法二、分離及培養（一）細菌的分離4．穿刺接種法5．傾注平板法6．涂布接種法第27頁/共54頁2023/3/1428第三節細菌的分離培養和鑒定（二）細菌培養方法

1．需氧培養法

2．二氧化碳培養法

3．厭氧培養法

第28頁/共54頁2023/3/1429第三節細菌的分離培養和鑒定三、生化反應和鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗

1.糖（醇、苷）類發酵試驗是鑒定細菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要第29頁/共54頁2023/3/1430第三節細菌的分離培養和鑒定2．氧化―發酵試驗（O/F試驗）主要用于腸桿菌科細菌與非發酵菌的鑒別，前者均為發酵型，而后者通常為氧化型或產堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。第30頁/共54頁2023/3/1431第三節細菌的分離培養和鑒定3．β―半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，而不發酵乳糖的細菌為陰性。本試驗主要用于遲緩發酵乳糖菌株的快速鑒定。第31頁/共54頁2023/3/1432第三節細菌的分離培養和鑒定4．七葉苷水解試驗主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。5．甲基紅試驗主要用于鑒別大腸埃希菌與產氣腸桿菌。6．V―P試驗本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。第32頁/共54頁2023/3/1433第三節細菌的分離培養和鑒定2．吲哚(靛基質)試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。（二）蛋白質和氨基酸的代謝試驗1．明膠液化試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。第33頁/共54頁2023/3/1434第三節細菌的分離培養和鑒定3．硫化氫試驗培養基：醋酸鉛培養基應用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別第34頁/共54頁2023/3/1435第三節細菌的分離培養和鑒定4．尿素分解試驗主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。5．苯丙氨酸脫氨酶試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細菌均為陽性，腸桿菌科中其他細菌均為陰性。6．氨基酸脫羧酶試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。第35頁/共54頁2023/3/1436第三節細菌的分離培養和鑒定（三）碳源和氮源利用試驗1．枸櫞酸鹽利用試驗用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。2．丙二酸鹽利用試驗腸桿菌科中屬間及種的鑒別。第36頁/共54頁2023/3/1437第三節細菌的分離培養和鑒定（四）各種酶類試驗1．氧化酶試驗主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別。2．過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）用于革蘭陽性球菌的初步分群。第37頁/共54頁2023/3/1438第三節細菌的分離培養和鑒定3．硝酸鹽還原試驗本試驗在細菌鑒定中廣泛應用。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。第38頁/共54頁2023/3/1439第三節細菌的分離培養和鑒定4．脂酶試驗主要用于厭氧菌的鑒別。5．卵磷脂酶試驗主要用于厭氧菌的鑒定。6．

DNA酶試驗在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產生

DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌和變形桿菌產生此酶。第39頁/共54頁2023/3/1440第三節細菌的分離培養和鑒定8．

CAMP試驗在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。7．凝固酶試驗作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。第40頁/共54頁2023/3/1441第三節細菌的分離培養和鑒定（五）抑菌試驗1．

O/129抑菌試驗用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。2．桿菌肽試驗用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別。3．奧普托欣（Optochin）試驗主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。第41頁/共54頁2023/3/1442第四節細菌的非培養檢測方法一、免疫學檢測抗原檢測、抗體檢測二、分子生物學檢測核酸雜交、聚合酶鏈反應、生物芯片技術三、細菌毒素的檢測內毒素、外毒素四、動物實驗

第42頁/共54頁2023/3/1443第四節

細菌的非培養檢測方法一、免疫學檢測（一）抗原檢測免疫熒光技術是利用免疫學特異性反應與熒光示蹤技術相結合的顯微鏡檢查手段。既保持了血清學的高特異性，又極大地提高了檢測的敏感性，在細菌鑒定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、間接法和免疫熒光菌球法。第43頁/共54頁2023/3/1444第四節

細菌的非培養檢測方法一、免疫學檢測（二）抗體檢測抗體的量常隨感染過程而增多，表現為效價的升高。因此用已知的細菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應抗體及其效價的動態變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。主要適用于抗原性較強的致病菌和病程較長的感染性疾病。第44頁/共54頁2023/3/1445第四節

細菌的非培養檢測方法二、分子生物學檢測（一）核酸雜交

DNA可進行變性、復性、雜交。我們利用這一特性，制備特定序列DNA片段，進行標記后用作探針，在一定條件下，按照堿基互補配對原則與標本中已變性的細菌DNA進行雜交，通過檢測雜交信號確定是否發生雜交反應，從而鑒定標本中有無相應的病原菌基因。第45頁/共54頁2023/3/1446第四節

細菌的非培養檢測方法二、分子生物學檢測（一）核酸雜交

1.探針的種類（1）全染色體DNA探針（2）染色體克隆片段DNA探針（3）質粒DNA探針（4）rRNA基因探針（5）寡核苷酸探針第46頁/共54頁2023/3/1447第四節

細菌的非培養檢測方法2．核酸雜交在臨床細菌檢測中的應用（1）細菌分類鑒定（2）細菌快速鑒定（3）細菌耐藥性的檢測（4）細菌毒素的檢測（5）細菌流行病學調查第47頁/共54頁2023/3/1448第四節

細菌的非培養檢測方法（二）聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）

1.特異性DNA體外擴增技術

2.特異、靈敏、快速、操作簡便

3.廣泛應用于細菌的鑒定第48頁/共54頁2023/3/1449第四節

細菌的非培養檢測方法PCR在臨床細菌檢測中的應用1.細菌的快速檢測2.細菌毒素的檢測3.細菌耐藥性的檢測4.細菌流行病學調查第49頁/共54頁2023/3/1450第四節