獸醫疫病監測診斷技術

提綱疫病面臨的復雜形勢常用實驗室檢測技術動物疫病診斷技術現狀

及應用

檢測技術發展方向與未來展望

1疫病面臨的復雜形勢

禽病種類多農業部《一、二、三類動物疫病病種名錄》中列入157種；其中一類禽病2種（高致病性禽流感、新城疫）；二類禽病18種（雞傳染性喉氣管炎、雞傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、馬立克氏病、產蛋下降綜合征、禽白血病、禽痘、鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨漿膜炎、小鵝瘟、禽霍亂、雞白痢、禽傷寒、雞敗血支原體感染、雞球蟲病、低致病性禽流感、禽網狀內皮組織增殖癥）；三類禽病4種（雞病毒性關節炎、禽傳染性腦脊髓炎、傳染性鼻炎、禽結核?。?。4病毒病原毒株多、變異快口蹄疫：7個型，多個亞型；我國O型、亞洲I型、A型禽流感：A、B、C3個型；其中B、C兩型僅能對人致病，A型可對人、豬、馬和禽致病。A型：H1~H16亞型；H5亞型：變異株不斷出現……新城疫：病毒分為低毒力型（即緩發型）、中等毒力型（即中發型）、強毒力型（即速發型）3型PRRS：1996年美洲型；2006年變異株；2009年歐洲型1株。2012年列入國家監測計劃的動物疫病（16種）高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性藍耳病、豬瘟雞新城疫、布魯菌病、牛結核病、血吸蟲病、狂犬病牛海綿狀腦病、癢病、牛傳染性胸膜肺炎、牛瘟、小反芻獸疫、非洲豬瘟、藍舌病國家強制免疫動物疫病外來動物疫病6主要疫病的國家指定監測方法病名指定診斷方法高致病性禽流感血凝抑制試驗（HI）雞新城疫血凝抑制試驗（HI）傳染性法氏囊病血凝抑制試驗（HI）、ELISA傳染性支氣管炎血凝抑制試驗（HI）口蹄疫正向間接血凝試驗、液相阻斷ELISAVP1-ELISA豬瘟正向間接血凝試驗、阻斷ELISA高致病性豬藍耳病ELISA疫苗種類各異、診斷試劑和方法多樣以禽流感為例血清學診斷技術

分子診斷技術

血凝與血凝抑制試驗神經氨酸酶抑制試驗酶聯免疫吸附試驗免疫熒光技術中和試驗瓊脂擴散試驗RT-PCR和RealtimeRT-PCR熒光RT-PCR、RT-PCR-ELISA依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)環介導的等溫擴增技術(LAMP)基因芯片技術82常用實驗室檢測技術常用實驗室檢測技術組織病理學檢測技術血清學檢測技術分子生物學檢測技術病原學檢測技術診斷新技術組織病理學檢測技術1.病理學檢測技術

是利用疫病引起的動物組織發生特征性的病變和病理變化對動物疫病進行診斷。2.免疫病理學檢測技術(免疫組織化學技術)

免疫組織化學方法不僅可在臟器組織中特異地檢出病原,又可發揮病理學檢測所具有直觀、抗原定位準確的特點,還可在臟器組織原位檢測出病原（原位PCR）的同時，觀察到組織病變與該病原的關系，從而有助于了解疫病的發病機理和病理過程。血清學檢測技術按其反應性質的不同可分為：凝集性反應(如凝集試驗和沉淀試驗)

標記抗體技術(包括熒光抗體、酶標抗體、放射性標記抗體等特點：敏感、快速（ELISA只需要1~2小時）。補體參與的反應(補體結合試驗、免疫粘附血凝試驗等)。中和試驗(病毒中和試驗和毒素中和試驗)特點：時間長，約需要18小時才能獲得結果。正向間接血凝診斷技術特點：正向間接血凝為一種微量的定量反應試驗，其應用廣泛，其無需昂貴的設備，操作簡單，并且有快速、敏感、特異性。操作要點及注意事項：A.試驗準備：制備1%紅細胞懸液；選用孔底應光潔透明無可見附著物的反應板(一次性的最好)；待檢血清要新鮮，未腐敗、溶血，無懸浮物。B.操作過程：盡可能的保證樣品被全部加入反應孔；每次滴加抗原前應充分搖勻，從稀釋度高的孔開始加起，并避免滴頭和孔內的液體直接接觸；避免稀釋時孔內產生氣泡，直接影響結果判定。C.結果判定：正確判斷50%凝集反應待檢樣品2待檢樣品1陽性對照陰性對照凝集和凝集抑制反應原理示意圖酶聯免疫吸附試驗（ELISA）具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便、重復性好、安全、適合大批量標準化檢測的特點。是當前應用最廣、發展最快的一項新技術，目前該方法已被廣泛用于多種細菌和病毒等疾病的診斷。其基本過程是將抗原(或抗體)吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應，底物顯色后用酶標儀判定結果。

間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗檢測液相中未知抗體雙抗夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體ELISA類型酶聯免疫吸附試驗

(ENZYME-LINKEDIMMUNOSORBENTASSAY,ELISA)3.原理（以間接性ELISA為例）：顯色間接ELISA檢測抗體雙抗原（體）夾心法測抗體（原）包被抗原*酶標抗原待測抗體包被抗體*酶標抗體待測抗原雙抗體夾心法雙抗原夾心法雙抗體夾心法檢測抗原流程圖競爭ELISA檢測抗體示意圖分子生物學檢測技術用于動物疫病特異性病原基因、病原基因變異與進化分析，及時準確掌握動物疫病分子流行病學動態，為疫病防治提供基因理論分析依據。核酸探針技術、基因序列分析比如基因芯片試劑盒等。聚合酶鏈反應（PCR）（應用最廣）1、疫病的早期診斷和不完整病原的檢測2、快速、準確、安全的檢測病原體3、在病原體分類和鑒別中的應用PCR儀基因芯片儀聚合酶鏈式反應（PCR)

是以DNA高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸為原理設計的。通過PCR技術獲取病原微生物的特異DNA片段，從而為疾病診斷提供重要依據。特點：特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。23反轉錄PCR技術即RT-PCR技術。用于檢測RNA病毒。首先提取總RNA，然后加入引物在反轉錄酶的作用下合成cDNA，加熱變性成為單鏈cDNA后，加入與之互補的另一對引物，進行PCR反應。分為一步法和兩步法兩種RTRT-PCR反應原理圖多重PCR技術(MULTI-PCR）

它是一種特殊的PCR形式，其最突出的特點是一次PCR反應．在同一反應體系中同時加入多對不同PCR引物和相應的模板，可同時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特優勢和很高的實用價值。病原學檢測技術1.細菌的分離與鑒定2.病毒的分離與鑒定

是病毒性疫病檢測、診斷、流行病學調查和未知新病毒進行分類鑒定的重要方法之一。但是對實驗室能力要求較高，且耗時長。

3.寄生蟲檢測寄生蟲病診斷中其定性的實質性方法有以下幾種:蟲卵檢查法、蟲體檢查法、免疫學檢查法和分子生物學檢查法。診斷新技術我國免疫預防為主的動物防疫政策，決定了在現實的動物疫病監測工作中，迫切需要實用的對動物疫病病原的快速診斷技術以及能區分免疫動物和自然感染動物的鑒別診斷技術。目前國內符合上述要求的診斷新技術主要有以下4種:1.免疫膠體金快速診斷試紙條

2.熒光PCR3.鑒別診斷技術4.原位PCR技術免疫膠體金快速診斷試紙條膠體金技術（Immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為示蹤標記物應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術。簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時間更長。結果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：因為該技術大多用單克隆抗體標記，這決定了它具有很好的特異性。膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態。29膠體金試紙條示意圖檢測線質檢線吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜連接墊（膠體金墊）背襯（底板）30實時熒光定量PCR與普通PCR相比：1.自動化程度高，極短的檢測時間（沒有了制膠和PCR產物電泳步驟，快速熱循環儀也縮減了運行時間，在30分鐘內可以得到完美的實驗結果）；2.敏感性為普通PCR的100倍；3.直觀的軟件分析；4.有效解決PCR污染問題；5.安全性更好。6.不足：資金投入大，檢測成本高。實時熒光定量PCR反應軟件分析截圖實時熒光定量PCR儀31如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。32定量原理

確定初始模板的濃度初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環數越少Log濃度與循環數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環數就可計算出樣品中所含的模板量33鑒別診斷技術鑒別診斷技術的重要性：

A：區分自然感染抗體和疫苗免疫抗體的鑒別診斷技術；B：從普遍免疫的動物群體中甄別出自然感染和帶毒的動物。該項技術的核心是基因工程技術、單克隆抗體技術與診斷技術的綜合運用，其科技水平高，難度較大。單克隆抗體技術目前市場上已有部分利用單克隆抗體制備的ELISA試劑盒（比如豬瘟）。原位PCR——分子病理學新技術是一種將PCR技術與原位雜交技術結合起來的可以檢測組織細胞中微量DNA或RNA且可精確定位的新技術。特點：敏感度更高，優于免疫組化技術。目前應用情況：主要用于病毒檢測，也有檢測組織中寄生蟲感染的報道。3檢測技術發展方向與未來展望血清學檢測技術發展方向簡單、快速便于普及的快速診斷技術

以膠體金標記技術為代表，操作簡單、快捷，實現現地現用。高度集成、自動化的儀器診斷技術

以ELISA（全自動酶免工作站）為代表，可實現大規模操作，且靈敏度高、特異性強。分子檢測技術的發展方向1、自動化

利用全自動儀器完成核酸提取、反應液配制、上機反應和結果分析的所有步驟多功能新型生物液體處理工作站：可以一機實現DNA/RNA提取和PCR反應建立實時熒光定量PCR儀：可以一機實現上機反應和結果分析2、高通量

在提高靈敏