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文檔簡介
第二章基因工程的工具酶演示文稿當前1頁,總共35頁。優選第二章基因工程的工具酶當前2頁,總共35頁。二.寄主的限制和修飾現象當前3頁,總共35頁。
限制(Restriction):指一定類型的細菌可以通過限制性內切酶的作用,破壞入侵的噬菌體DNA,導致噬菌體的寄主幅度受到限制。限制作用:實際就是限制性內切酶降解外源DNA,維護宿主遺傳穩定的保護機制。當前4頁,總共35頁。修飾(modification):指寄主本身的DNA,由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化,使DNA得以修飾,從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用:宿主細胞通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。當前5頁,總共35頁。1)
菌株中有三個連鎖的基因位點:hsdR、hsdM、hsdS。2)
hsdR編碼限制性核酸內切酶---識別DNA分子特定位點,將雙鏈DNA切斷。
(DNA分子轉化細胞:受體細胞去掉hsdR基因位點)3)
hsdM編碼產物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點的堿基甲基化反應。4)
hsdS表達產物的功能是---協助限制性核酸內切酶和甲基化酶,識別特殊的作用位點。
三.限制和修飾作用的分子機制當前6頁,總共35頁。當前7頁,總共35頁。四.限制性核酸內切酶的概念和命名
概念:一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA雙鏈結構的核酸水解酶。
命名:1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出了命名原則,1980年Roberts在此基礎上進行了系統分類:★用具有某種限制性酶有機體的屬名第一個字母(大寫)和種名的前兩字母(小寫)組成3個字母的略語作為該酶的基本名稱。★如果酶是存在于特殊的菌株中,還應在第3個字母后面標注菌株名稱的符號株或型(strain)
。★如果一種特殊的菌株具有幾個不同的限制與修飾體系,則以羅馬數字表示該菌株中發現某種酶的先后次序。當前8頁,總共35頁。Hind
III屬名種名
株名
發現順序Hin
d
III嗜血流感桿菌(Haemophilusinfluenzae
)
d株所發現的第三個限制性內切酶。EcoRⅠ來自于EscherichiacoliRY13的第一個限制酶。舉例+讀法當前9頁,總共35頁。五.限制性內切酶的種類識別序列切割序列限制酶的作用模型識別序列:是一段特殊的DNA序列,該序列與其對應的限制性內切酶結合,是該酶切割DNA的前提。切割序列:識別完成后,限制性內切酶實施切割作用所在的DNA序列。當前10頁,總共35頁。Ⅰ型酶:1968年,M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內切酶。特征:分子量較大,反應需Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、ATP等。這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點,而且切割是隨機的,所以在基因工程中應用不大。
由于切割的隨機性,不能得到目的片段。當前11頁,總共35頁。Ⅲ型酶:這類酶可識別特定堿基序列,并在這識別位點下游的3’端24~26bp處切開DNA,所以它的切割位點也是沒有特異性的。
Ⅱ型酶(重點)★1970年,Smith和Wilcox在流感嗜血d株中分離出來的限制酶。★分子量通常較小,只有一種多肽,以同源二聚體的形式存在。反應只需Mg2+的存在。★特點:(1)識別位點是一個回文對稱結構,并且切割位點也在這一回文對稱結構上。(2)許多Ⅱ型酶切割DNA后,可在DNA上形成粘性末端,有利于DNA片段的重組。當前12頁,總共35頁。Ⅲ型酶:這類酶可識別特定堿基序列,并在這識別位點下游的3’端24~26bp處切開DNA,所以它的切割位點也是沒有特異性的。
Ⅱ型酶(下節重點)
當前13頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征絕大多數II型限制性內切酶都能識別由4-6個核苷酸組成的特定序列。6.1每一種酶都有各自的特異識別序列限制性內切酶是在DNA分子雙鏈的識別序列內切割DNA分子,因此識別序列又稱為該限制性內切酶靶序列。
EcoRI:GAATTCBamHI:GGATCCPstI:CTGCAGSmaI:GGGCCC當前14頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征限制性內切酶II的識別序列具有雙重(180度)旋轉的對稱結構,也就是說識別序列的核苷酸對是呈回文結構。AGCGCTTCGCGAACNGTTGNCA當前15頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征習題:下列序列中哪些可能是II類限制酶的識別序列?
A:ATATCGB:CCCGGGC:GATATCD:AGCCGA2個方法:對折or寫出互補鏈當前16頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式平末端的DNA片段5`端具有粘性末端的DNA片段3`端具有粘性末端的DNA片段切割位點位于識別序列的對稱軸上,這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷,不易重新環化。切割位點位于對稱軸的兩側,產生突出末端,在適當溫度下,產生的末端可以退火互補,重新連接。CCCGGGGGGCCC5’5’CCC
GGGGGG
CCC5’5’SmaI當前17頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式當前18頁,總共35頁。識別序列切割位點粘性末端當前19頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點識別序列不同,切割方式也不同。EcoRI酶切產生的5’粘性末端;PstI酶切產生的3’粘性末端;Pvull酶切產生的平頭末端;當前20頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點識別序列不同,切割方式也不同當前21頁,總共35頁。當前22頁,總共35頁。當前23頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點識別序列不同,產生相同的粘性末端——同尾酶。一些限制性內切酶,它們雖然來源各異,識別的靶序列也各不相同,但都產生出相同的粘性末端,稱之為同尾酶。由一對同尾酶分別產生出的粘性末端共價結合形成的位點,稱之為雜種位點(hybridsite)。實例(百度文庫——自學):1.利用三引物PCR和同尾酶連接的策略實現多基因片段的重組。2.同尾酶技術在構建瘧疾多價重組DNA疫苗中的應用。
當前24頁,總共35頁。雜種位點(hybridsite):由一對同尾酶分別產生的粘性末端共價結合形成的位點。
一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。BamHⅠ
GGATCC
BclⅠ
TGATCA
CCTAGG
ACTAGT
雜種位點
TGATCC
A
CTAG
GSau3AⅠ當前25頁,總共35頁。當前26頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點識別簡并序列
簡并序列是指序列中有的核苷酸位點可以是不同的核苷酸。例如:GTYRACY=C或TR=G或A
HindⅡ實際上可以識別4個特定序列。
當前27頁,總共35頁。六.Ⅱ型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特點
識別序列相同,切割位點不同——同位酶。一些限制性內切酶,具有相同的識別位點,但切割部位不同,這類酶稱為同位酶。SmaⅠCCCGGGCCCGGGXmaⅠ雙酶切&酶的價格當前28頁,總共35頁。一些來源不同的限制性內切酶,具有相同的識別位點和切割位點,這類酶稱為同裂酶。如:HpaII/MspI。
CCGGHpaII不能切割MspI能夠切割C*CGGC*CGG表示甲基化6.3限制酶的切割特點六.Ⅱ型限制酶的基本特征當前29頁,總共35頁。Ⅱ型限制性內切酶不具甲基化功能。Ⅰ、Ⅲ型限制性內切酶本身具有甲基化酶的功能。Ⅱ型限制性內切酶甲基化:由相應的甲基化酶承擔。6.3限制酶的切割特點GAATTCCTTAAGEcoRⅠ甲基化酶AAEcoRⅠ六.Ⅱ型限制酶的基本特征當前30頁,總共35頁。七.Ⅱ型限制酶的主要用途①在特異位點上切割DNA,產生特異的限制酶片段。②建立DNA分子的限制酶圖譜。③構建基因文庫。④用限制酶切出的相同粘性末端,以便重組。⑤改建質粒。當前31頁,總共35頁。八.酶切反應的操作◆大部分II型限制性核酸內切酶需要相似反應條件:
Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/L
NaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μL
Temperature37℃Time1-1.5h◆1個單位限制性核酸內切酶:在建議使用的緩沖液及溫度下,在20μL反應液中反應1h,使1μg標準DNA完全消化所需的酶量。bufferHMKL???當前32頁,總共35頁。+-電泳紫外分析37℃1h加反應液CKMBuffer(10X)2.0L(總體積決定)Water16.5L(可變)DNA1.0Lor1.0
g(可變)Enzyme0.5-1.0LVolume20.0L1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT八.酶切反應的操作當前33頁,總共35頁。對鹽濃度要求相同的酶,原則上可以同時酶切。對鹽濃度要求不同的酶,可采取下列方法:使用較貴的酶的鹽濃度,加大便宜酶的用量,同時酶解。低鹽酶先切,然后補加鹽,高鹽酶再切。一種酶先切,然后更換緩沖液,另一種酶再切。0.1倍體積的5MNaAcpH
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