關于高效液相色譜儀的使用第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日一、概述色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年提出。分離出胡蘿卜素、葉綠素和葉黃素。因一戰爆發并未重視。第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱固定相流動相色譜法第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜的發展20世紀70年代高效液相色譜出現1906色譜法發明20世紀50年代氣相色譜出現并廣泛使用19世紀中葉人們開始注意一些簡單的擴散現象染料目前HPLC已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜的類型氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相色譜液相色譜柱色譜紙色譜薄層色譜高效液相色譜HPLC氣相色譜第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日1.HPLC與經典LC

HPLC比起經典LC的最大優點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經典液相色譜法快數百倍。經典色譜是重力加料，流出速度極慢，流動相速度為30ml·h-1，需用20h才能分離出20種氨基酸；而HPLC配備了高壓輸液設備，流速最高可達10ml·min-1，只需lh之內即可完成氨基酸的分離。第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日高效：固定相具有分離效果好、效率高，如用C18柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內分離出尿中104個組分。高靈敏度：高靈敏度檢測器，可檢測μM級甚至nM級別的待測物。高自動化：操作自動化，可儀器控制流動相比例、流速、波長、出峰時間、進樣及自動生成分析報告等。第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日2.HPLC與GC（l）氣相色譜法(GC)分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數的20％。對于占有機物總數近80％的那些高沸點、熱穩定性差、摩爾質量大的物質，目前主要采用HPLC進行分離和分析。（2)GC中流動相是惰性氣體，它與組分沒有親和力，僅起運載作用。而HPLC中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用。（3）GC一般都在較高溫度下進行的，而HPLC可在室溫條件下工作。第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日HPLC應用（1）生命化學：蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、酶、維生素等物質的分離和測定；（2）化學與精細化工：植物色素、高聚物、染料、化工產品、合成化合物等的分離和分析；無機離子的測定等；（3）農業、食品與醫藥學：添加劑（甜味劑、防腐劑、著色劑）、營養成分（蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸等）、藥物體液中代謝物測定；藥代動力學研究；臨床藥物、農藥殘留等；（4）環境分析與毒理學：多環芳烴及農藥殘留、DNA加合物分析。優點是靈敏度高，分離效果好；缺點是儀器設備費用昂貴，需摸索分析方法，操作嚴格，這是它的主要缺點。

第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日二、液液色譜法的分類液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為：正相色譜法反相色譜法第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日正相色譜法固定相極性大于流動相。采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環已烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日反相色譜法固定相極性小于流動相。一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。它在液相色譜中應用最為廣泛，占整個HPLC應用的80%左右。C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日三、色譜法的分離原理分離原理樣本組分進樣到色譜柱上時，會與固定相發生作用，包括吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等作用。當流動相洗脫色譜柱時，由于各組分與固定相作用的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，和固定相結合弱的組分先出來，結合強的后出來，不同組分會先后從固定相中流出，一個物質會形成一個色譜峰。色譜法由于能分離許多物質，被稱為分離的巨人。第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。←色譜峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應值第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日基本術語色譜圖(chromatogram)——樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線。基線(baseline)——在正常操作條件下，僅由流動相所產生的響應信號的曲線。噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。色譜峰(peak)——組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態分布曲線。不對稱色譜峰有兩種：前延峰和拖尾峰。前者少見，可能是柱子出問題。第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日保留時間(retentiontime，tR)——組分從進樣到出現峰最大值所需的時間。理論塔板數(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。

當色譜柱長度一定時，塔板數N越大，被測組分在柱內被分配的次數越多，柱效能越高，所得色譜峰越窄。第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日峰高(peakheight，h)—峰的最高點至峰底的距離。峰面積(peakarea，A)—峰與峰底之間的面積,又稱響應值。精密度—日間、日內精密度準確度—加標回收率值為（加標樣的量－樣品量）×100%

標品的量標準曲線第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日定性定量分析及色譜圖標準品-保留時間9.3min標準物質確定物質保留時間定性第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜法定性定量分析1.根據色譜峰的保留值，可以進行定性分析。2.根據色譜峰的面積或峰高,可以進行定量分析。3.實驗過程（1）確定實驗條件（流動相、流速、檢測波長等）。（2）溶液的配制：流動相、標準品和待測樣品。（3）精密度和準確度實驗。（4）標準曲線測定。（5）樣品測定。第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜分析用水（1）專門的超純水機,得到Milli-Q水；（2）去離子水重蒸；（3）二次或三次重蒸水；（4）采用類似家用的純水機；（5）市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水。不管采用何種途徑，配制流動相應用新鮮水。理想的HPLC用水應為18.2Ω的超純水，并通過0.22μm的濾膜，除去有機物、無機離子及空氣等。第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫箱等。目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters公司、Agilent公司、島津公司等，國內有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京普析分析儀器廠等。四、儀器組成第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日數據分析系統輸液系統進樣系統分離系統檢測系統HPLC的系統組成數據處理系統第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日島津公司LC-20第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日Agilent公司

1200LC第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日

為什么要用高壓輸液系統？由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統。它是高效液相色譜儀最重要的部件，泵的性能好壞直接影響到整個系統的質量和分析結果的可靠性。一元、二元、四元泵。HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。1.輸液泵

第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日輸液泵的主要性能①流速穩定：如1ml/min,其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流速量范圍寬：分析型應在0.1~10ml/min范圍內連續可調，制備型應能達到100ml/min；③輸出壓力高：一般應能達到25MPa或400巴;④密封性能好，耐腐蝕。第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日泵的保養使用流動相盡量要清潔，盡量帶進避免顆粒物質，造成泵內堵塞；進液處的砂芯過濾頭要經常清洗；流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下，以免產生結晶；泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，最終產生漏液；輸液泵的工作壓力決不要超過規定的最高壓力，否則會使高壓密封環變形，產生漏液；流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日2.進樣器2種方法：（1）一般常用六通進樣閥。可用微量注射器或定量環進樣。前者要求每次進樣體積準確、相同。后者進樣量應大于定量環體積的3~6倍，這樣才能完全置換定量環內的流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。（2）自動進樣用于大量樣品的常規分析。

第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日

六通閥進樣演示第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日3.色譜柱擔負分離作用，是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子。一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱由柱管、柱接頭、篩板（濾片）、堵頭和螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不銹鋼或鈦合金，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。常規分析的色譜柱有內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm。

第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱使用注意事項柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日進樣樣品要提純，避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理；在色譜柱前加預柱或保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱，可以起到保護、延長柱壽命的作用，可更換。每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結束后，都要用清洗柱；第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑如甲醇保存，擰緊柱接頭，防止溶劑揮發干燥。新柱不用是可放時間長些。柱壓升高的原因有樣品和流動相有雜質或顆粒、緩沖液鹽結晶使柱子堵塞、體系不平衡等。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日溶劑和樣品過濾對色譜柱、儀器起到保護作用。對色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。對儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日4.檢測器檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變為電信號。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復性好和適用范圍廣。檢測器的類型有紫外可見光、熒光、電化學、電導、放射性檢測器等。第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日性能指標

（1）噪音和漂移都會影響測定的準確度，應盡量減小。（2）靈敏度：表示一定量的樣品物質通過檢測器時所給出的信號大小。（3）檢測限（LOD）：試樣中被測物能被檢測到的最低量，以信噪比接近為3:1時的相應濃度作為檢測限。以信噪比接近為10:1時的相應濃度作為定量限（LOQ）第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日（4）線性范圍：指檢測器的響應信號與組分量成直線關系的范圍。檢測器所產生的信號與被測樣品的量呈一定的函數關系作為依據。線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些。

第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日5.色譜工作站色譜工作站主要有電腦、信號記錄系統和分析軟件。不同的色譜工作站在處理數據時情況不同，但目前大多是記錄儀記錄檢測信號，使用積分儀計算峰高、峰面積和保留時間等參數。好的工作站除能采集、處理和分析數據外，還能控制儀器操作，對色譜系統進行優化。第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日6.柱溫箱色譜柱和檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間。溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。

溫度對保留時間有影響。要根據色譜柱說明書上要求的最適宜溫度設置柱溫箱的溫度。第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日7.超聲脫氣流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起猝滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。一般流動相溶液需超聲20~30min。這種離線脫氣不能維持溶劑的脫氣狀態，在停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中，在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。在線（系統內）脫氣法無此缺點。第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日8.燈的保養熒光分析用的是氙燈，5000元左右，壽命在800小時左右。因此在色譜柱平衡得差不多、要開始分析時，再打開檢測器熒光燈；在分析完成后，馬上關閉氙燈。第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日五、儀器分析過程與操作1.流動相的貯存：

一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染，造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日2.流動相比例調整：

按經驗，主峰一般應調至保留時間為6~15分鐘為宜。所以建議第一次檢驗時請少配流動相，以免浪費。弱電解質的流動相其重現性更不容易達到，請注意充分平衡柱。流動相組成、pH、比例摸好后，即按此條件測定樣品。流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日3．樣品配制：玻璃容器必須洗凈，酸泡處理后使用，盡量少用或不用塑料容器。HPLC應用中要求用超純水或純凈水或三蒸水配置樣品。樣品配制應嚴格按照方法要求的步驟進行。樣品配制同時還需配制標準樣品，用于標準曲線的測定和目的峰的確定。第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日4.記錄時間：第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如50min-60min），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日5.進樣量：應注意進樣量要準確、一致。20微升或10微升可由預實驗或標準方法確定。

6.確定目的峰的保留時間。7.繪制標準曲線。8.測定精密度和準確度。9.樣品測定。10.分析數據。第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日Agilent1200LC操作步驟開機及分析（1）把流動相放入溶劑瓶中，用超聲波脫氣20min，放置20-30min后使用。（2）打開1200LC脫氣裝置、泵、檢測器及工作站電源。（3）打開電腦,進入在線分析系統。（4）打開控制異丙醇流速的閥，用注射器抽氣，直到液體流出，控制流速。第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日（5）排氣：打開“Purge”閥(往左扭松)，點擊“泵”圖標，點擊“設置泵”選項，設置流速1m