化學毒物的致突變作用第1頁/共52頁第八章化學毒物的致突變作用第2頁/共52頁第一節概述一、基本概念遺傳是生物保持其種族特性的根本；變異是生物物種推陳出新的來源。第3頁/共52頁一、基本概念突變：遺傳物質發生的可改變生殖細胞或體細胞中的遺傳信息，并產生新的表型效應的改變。突變類型：自發突變和誘發突變。致突變作用：外源化學物及其他環境因素引起核內遺傳物質發生變化，并且這種改變隨細胞分裂過程而傳遞的過程。第4頁/共52頁一、基本概念突變基因突變染色體畸變染色體結構異常染色體數目異常光鏡觀察。根據表型判斷；第5頁/共52頁二、遺傳學基礎（一）DNA-基因-基因組；（二）染色質與染色體1.“舒展以復制，濃縮以分離”；2.染色體與基因密切關聯。（三）體細胞與生殖細胞第6頁/共52頁二、遺傳學基礎（四）細胞周期與細胞分裂細胞周期間期G1期G2期S期有絲分裂期（M期）前期中期后期末期第7頁/共52頁有絲分裂（mitosis）第8頁/共52頁減數分裂（meiosis）第9頁/共52頁第二節化學毒物的致突變類型一、基因突變基因突變：組成一個染色體的一個或幾個基因中DNA序列發生的變化，又稱點突變。突變類型：堿基置換、移碼和大段損傷。第10頁/共52頁一、基因突變（一）堿基置換堿基置換：某一堿基配對性能改變或脫落所致的突變。突變類型：轉換和顛換。突變的后果：同義密碼、錯義密碼或終止密碼。第11頁/共52頁一、基因突變（二）移碼移碼：DNA中增加或減少了一對或不等于3的倍數的幾個堿基對所造成的突變。GCUGCUGCUAlaAlaAlaUGC

UG⑴GCUAGCAlaSerCysDNARNA蛋白質⑵GCUCUGCUG

CUAlaLeuLeu第12頁/共52頁一、基因突變（三）大段損傷大段損傷：DNA鏈大段缺失或插入，這種損傷有時可跨越兩個甚至數個基因。突變類型：基因Aab小缺失：插入：重排：baab第13頁/共52頁二、染色體結構異常

突變原因：染色體或染色單體斷裂，當斷端不發生重接或錯誤重接。檢查方法：光鏡檢查相應細胞有絲分裂中期的染色體。染色體化學斷裂劑擬紫外線斷裂劑：擬放射性斷裂劑：復制后復制后復制前第14頁/共52頁染色體結構異常類型：斷裂、倒位、缺失、重復、易位、環狀染色體等。三、染色體數目異常染色體數目異常整倍性畸變：例如23或69條染色體；非整倍性畸變：例如45或47條染色體。第15頁/共52頁第三節化學毒物致突變作用的機理及后果一、以DNA為靶的損傷機理（一）DNA加合物及交聯分子的形成許多化學誘變劑或其活性產物是親電子劑，極易與核酸或蛋白質等大分子的親核位點發生共價結合，形成加合物或交聯分子。例1.黃曲霉毒素B和苯并（a）芘經代謝活化形成環氧化物，然后與DNA共價結合生成加合物，從而誘發突變。例2.烷化劑的誘變作用。

第16頁/共52頁烷化劑的誘變作用：烷化劑：是一些可與大分子親核部位共價結合的親電子劑，通過提供烷基與DNA共價結合而誘發突變。如，硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯。例如，鳥嘌呤的O-6位被烷化常引起堿基錯配，由原來的G:C轉換為A:T。第17頁/共52頁烷化劑的誘變作用：烷化劑既可以是單功能的，也可是多功能的。前者與DNA中一個親核基團共價結合；后者有兩個或更多活性基團，每一分子可與DNA的兩個或多個部位結合，也稱交聯劑（crosslinker）。交聯劑可使DNA鏈內、鏈間或DNA與蛋白質之間發生交聯，而引發突變。第18頁/共52頁（二）堿基類似物的替代原理：一些堿基類似物可在DNA復制時摻入并與互補鏈上的堿基配對，這些類似物摻入后常常發生酮式和烯醇式的互變異構，在復制子代DNA時引起配對性質的改變，從而造成堿基替代突變。堿基類似物：5-溴尿嘧啶（BU）、2-氨基嘌呤（2-aminopurine,AP）。第19頁/共52頁5-溴尿嘧啶（BU）的替代：5-BU（酮式）:A；5-BU（烯醇式）:G；A?T摻入A?BU復制A?TG?BU＋復制G?CA?T＋T?A＋G?BU第20頁/共52頁（三）嵌入劑的誘變作用一些平面分子能以靜電吸附形式嵌入DNA單鏈堿基之間或DNA雙螺旋結構的相鄰核苷酸之間，稱為嵌入劑。例如吖啶橙、原黃素、吖黃素等吖啶類染料分子。若嵌入到新合成的互補鏈中，將使之失去一個堿基；嵌入到模板鏈的兩堿基之間，就會使互補鏈插入一個多余的堿基。這些改變將引起移碼突變。第21頁/共52頁嵌入劑的結構：NCCCCCCCCCCCCCNH2NH2原黃素NCCCCCCCCCCCCCN(CH3)2(CH3)2N吖啶橙第22頁/共52頁CCNHNCHHCNNNH2C腺嘌呤OCHC-CH3CHNNHOC胸腺嘧啶第23頁/共52頁（四）堿基的損傷一些誘變劑可以修飾堿基的化學結構，改變其配對性質而引發突變。例如，亞硝酸、羥胺、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍。含有NH2的堿基（A、G、C）都可以被亞硝酸損傷發生氧化脫氨反應，使氨基變為酮基，造成堿基轉換突變。第24頁/共52頁亞硝酸引發的突變機制：胞嘧啶HCCNNHCOCNH2糖基HNO2HCCNNHCOCO糖基尿嘧啶

將引發C?G→T?A的轉換。第25頁/共52頁二、不以DNA為靶的損傷機理（一）對DNA合成或修復酶系統的作用例如，誘變劑可對DNA聚合酶、錯配修復酶等與DNA合成或修復相關的酶系統作用，形成加合物，可以間接導致DNA損傷，從而引發基因突變或染色體畸變。第26頁/共52頁（二）對紡錘體的毒作用1.與微管蛋白二聚體結合微管蛋白二聚體是構成紡錘纖維的材料。秋水仙堿、鬼臼素等能與該蛋白的特定位點結合，抑制微管的組裝，從而引起細胞分裂完全抑制。2.與微管上的-SH結合鉛、鋅、汞、砷等可與微管蛋白上的-SH結合，而引起細胞分裂的部分抑制。第27頁/共52頁（二）對紡錘體的毒作用3.破壞已組裝好的微管細胞中，微管經常與游離的二聚體處于聚合與解聚的平衡狀態。微管結合蛋白（MAP）可使二聚體聚合，維持微管的結構與功能。灰黃霉素、秋水仙堿等能與MAP結合，導致組裝好的微管解聚。第28頁/共52頁（二）對紡錘體的毒作用4.妨礙中心粒移動中心體是一種與微管裝配和細胞分裂密切相關的細胞器，一般由一對相互垂直排列的中心粒和周圍的無定形物質構成。秋水仙堿能防礙有絲分裂早期兩對中心粒的分離和移向兩極，從而造成染色體數目的異常。第29頁/共52頁三、突變的后果化學誘變劑引起的突變后果體細胞突變生殖細胞突變基因突變染色體畸變遺傳易感性改變、遺傳性疾病、致死性突變。染色體病、死胎、自發流產等。不影響下一代，產生腫瘤、畸形、動脈粥樣硬化、糖尿病、衰老等后果。影響人類基因庫質量第30頁/共52頁三、突變的后果遺傳病：個體生殖細胞或受精卵的遺傳物質發生突變所引起的疾病，通常具有垂直傳遞和終生性的特征。基因庫：人群生殖細胞內所具有的能遺傳給下一代的全部基因的總和。（基因組：個體所具有的全部基因）。第31頁/共52頁第四節化學毒物致突變作用的研究方法一、常用的致突變試驗（一）細菌回復突變試驗細菌回復突變試驗是以營養缺陷型的突變體菌株為對象，觀察受試物能否引起其發生回復突變的方法。又稱Ames試驗。常用菌株:

組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和色氨酸營養缺陷型大腸桿菌。第32頁/共52頁野生型：生物群體中觀察到的最高頻率的表型，或具有這種表型的系統、生物和基因(即正常型)。正向突變：改變野生型性狀的突變。回復突變：突變體經過第二次突變又完全地或部分地恢復為原來的基因型和表型。第33頁/共52頁（一）細菌回復突變試驗鼠傷寒沙門氏菌野生型（His+）組氨酸缺陷型突變株（His－）？受試物（直接或前突變物）±代謝活化系統第34頁/共52頁代謝活化系統：S9混合液（10%）的組分：

磷酸鹽緩沖液

KCl溶液

MgCl2

溶液葡萄糖-6-磷酸鈉溶液

NADP+溶液

肝S9液

肝S9液：多氯聯苯誘導的大鼠肝組織勻漿，經9000g離心得到的上清液，主要成分為肝細胞微粒體。第35頁/共52頁（一）細菌回復突變試驗試驗方法：點試驗法平板摻入法測試菌株±S9，缺乏組氨酸測試菌株+受試物±

S9，缺乏組氨酸

一般先用點試驗法作預實驗，平板摻入法是標準試驗方法。受試物點于濾紙片上第36頁/共52頁（二）小鼠淋巴瘤細胞tk基因突變實驗原理：哺乳動物基因突變試驗主要采用嚙齒類動物或人的培養細胞進行正向突變試驗。常用的方法有：小鼠淋巴瘤（L5178Y）細胞胸苷激酶位點（tk）突變檢測；中國倉鼠卵巢（CHO）細胞及中國倉鼠肺（V79）細胞次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶位點（hgprt）突變檢測。第37頁/共52頁（二）小鼠淋巴瘤細胞tk基因突變實驗dUMPdTMPDNA甲基化胸苷+PidTMPDNA胸苷激酶（TK）5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）三氟胸苷（TFT）細胞死亡第38頁/共52頁（二）小鼠淋巴瘤細胞tk基因突變實驗小鼠淋巴瘤細胞（tk基因）受試物±代謝活化系統嘧啶類似物存在下的存活情況第39頁/共52頁（三）微核試驗微核是染色體的無著絲粒片段或整條染色體在細胞分裂后期，不能進入子代細胞核中，而在子代細胞的間期胞漿內形成的游離團塊物質，它與細胞核著色一致但體積小。微核試驗用于檢測染色體斷裂劑及非整倍體誘變劑。第40頁/共52頁小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗原理：當成紅細胞發展為紅細胞時，主核排出，成為多染紅細胞，然后成為正染紅細胞進入外周血中。在主核排出時，微核可留在胞漿中，并維持一定時間。觀察并計數多染紅細胞中的微核，可反映染色體斷裂劑和紡錘體的損傷情況。第41頁/共52頁小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗原理：骨髓血液成紅細胞多染紅細胞正染紅細胞小鼠受試物第42頁/共52頁（四）染色體畸變試驗制備中期分裂相染色體標本，光鏡下可直接觀察染色體的數目和形態的改變。染色體畸變試驗也稱為細胞遺傳學試驗。染色體畸變試驗可進行體內試驗，也可進行體外試驗；可進行體細胞的分析，也可進行生殖細胞的分析。第43頁/共52頁（五）程序外DNA合成試驗原理：正常細胞一般僅在間期的S期進行DNA的復制合成，稱為“程序性DNA合成”。當DNA受損后，DNA的修復合成可發生在S期以外的其他時期，稱為“程序外DNA合成”。第44頁/共52頁（五）程序外DNA合成試驗方法：用無精氨酸的培養基將細胞阻斷于G1期，并用藥物（羥基脲）將正常的DNA半保留復制阻斷。然后用受試物處理細胞，并在加有[3H]-胸苷的培養液中培養。如果受試物損傷了DNA，并啟動了DNA損傷修復合成，[3H]-胸苷就會摻入到DNA鏈中，利用放射自顯影測定DNA的放射活性，即可了解受試物對DNA鏈的損傷情況。第45頁/共52頁（六）果蠅伴性隱性致死試驗原理：利用果蠅的眼色性狀是由X染色體上的基因決定，并與X染色體的遺傳相關聯的特征來觀察X染色體上基因的突變情況。主要用于雄性生殖細胞遺傳損傷的分析。B：棒眼，b：圓眼；Bb：腎形眼。

W：紅眼，w：杏眼。第46頁/共52頁（六）果蠅伴性隱性致死試驗×P：♂XWY（紅色圓眼）b♀XwXw（杏色棒眼）BF1：×XWXwbBXw

YBF2：XwY（杏棒）XwXw（杏棒）XwXWY（紅圓）XWXw（紅腎）XWYXw

精子卵子bBbBBbBBBB第47頁/共52頁二、致突變試驗注意事項：（一）體外試驗的活化系統大鼠肝原代細胞；②

S9混合液。S9混合液的特點：優點：S9可活化大多數前致突變物；缺點：①對通過其他方式活化的前致突變物，S9不適用；②S9中的親核物質可能會影響試驗