關于高中生物基因工程的基本操作程序新人教版選修第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日一.目的基因的獲取1.基因的結構2.目的基因的概念3.目的基因的獲取的方法第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1.基因的結構（1）原核生物基因結構編碼區非編碼區非編碼區編碼區上游編碼區下游編碼蛋白質調控遺傳信息的表達（調控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…啟動子終止子第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日編碼區非編碼區非編碼區啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日編碼區非編碼區非編碼區（能編碼蛋白質）啟動子終止子（2）真核與原核生物基因結構的比較外顯子內含子編碼蛋白質（不能編碼蛋白質）①相同點：都是由能夠編碼蛋白質的編碼區和具有調控作用的非編碼區。②不同點：原核細胞基因的編碼區是連續的；真核細胞的編碼區是間隔的，不連續的。第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日2.目的基因的概念主要是指編碼蛋白質基因例如：與生物抗逆性相關的基因，與生物優良品質相關的基因，藥物和保健品相關的基因，與毒物降解相關的基因，以及與工業所需要酶相關的基因。

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日3.目的基因的獲取的方法（4）從已有物種分離出目的基因（3）用化學方法直接人工合成目的基因（1）從基因庫中獲取目的基因（2）應用PCR技術擴增目的基因第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日（1）從基因庫中獲取目的基因①基因文庫和部分基因文庫的慨念②基因組文庫和cDNA文庫的主要區別③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日①基因文庫和部分基因文庫的慨念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫。

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫。如：cDNA文庫。第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日基因組文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫方法一：直接分離法(鳥槍法)第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日②在細胞質中將mRNA分離并加入反轉錄酶③合成第二條DNA鏈外顯子內含子外顯子外顯子內含子真核細胞的基因①在細胞核內轉錄RNA②在核內內含子被切去，外顯子彼此連接③在細胞質中將mRNA分離并加入反轉錄酶④合成第二條DNA鏈基因的cDNA不含內含子mRNA原核細胞的基因①在細胞質內轉錄第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日②基因組文庫和cDNA文庫的主要區別

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子(位于編碼蛋白質序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因

根據目的基因的有關信息，例如，根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因。第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日（2）應用PCR技術擴增目的基因①定義：②原理：DNA復制PCR是聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術，在短時間內大量擴增目的基因DNA分子熱變性（在90～95OC時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結合成雙鏈）因此，在PCR技術中不需要解旋酶（與復制不同之在處)③儀器：PCR擴增儀（自動調控溫度的儀器）④條件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物，脫氧核苷酸，酶等。第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日④過程：a.DNA熱變性（90～95OC)：b.復性（55～60

OC)

：c.延伸（70～75OC)：d.重復a.b.c步驟：

雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形成單鍵DNA

系統溫度降低，引物結合到互補DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA

在Taq酶作用下，合成與模板互補的DNA子鏈，形成雙鏈DNA

每重復一次，目的基因增加一倍PCR擴增為指數形式擴增2n(n為擴增循環的次數），在短時間內擴增大量目的基因。第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日用化學方法直接人工合成目的基因①反轉錄法mRNA→RNA與DNA雜交鏈→單鏈DNA→雙鏈DNA逆轉錄酶核苷酸酶HDNA聚合酶cDNA②化學合成法氨基酸序列→mRNA序列→目的基因序列→目的基因推測合成思考：

不具有，缺少非編碼區(啟動子、終止子）和非編碼序列（如內含子），要人工構建。人工合成的目的基因是否具有完整基因結構的基因？推測第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1.作用：二.基因表達載體的構建——核心IMN2.組成：①使目的基因在受體細胞中穩定存在并遺傳給子代。②同時使目的基因能表達和發揮作用。(3)終止子：是使轉錄在需要的地方停止。(4)標記基因：是鑒別受體細胞中是否含有目的基因從而將含有目的基因的細胞篩選出來。(2)啟動子：是RNA聚合酶識別和結合部位。(1)目的基因。（5）復制原點：是轉錄和復制的起點。

不同受體細胞，目的基因導入受體細胞的方法不同，基因表達載體的構建有所差異。第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日導入接種培養接種培養接種培養接種培養含有四環素的完全培養基完全培養基大腸桿菌不含抗四環素基因證明：不存活含有四環素的完全培養基證明：大腸桿菌含抗四環素基因證明：

大腸桿菌的受體細胞含有目的基因

四環素抗性基因

四環素抗性基因完全培養基存活如何把導入了目的基因的受體細胞篩選出來？第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日存活的大腸桿菌培養培養質粒來源：大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養基含有四環素的完全培養基人工改造質粒（選擇具有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因農桿菌）質粒知識拓展第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNA質粒構建表達載體四環素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨芐青霉素抗性基因DNA連接酶人類胰島素的基因第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日培養培養培養導入含目的基因的重組質粒導入大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養基含有四環素的完全培養基兩種培養基均不能生長大腸桿菌Ca2+

處理細胞形成感受態細胞檢測（培養不具有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性積基因的大腸桿菌）只有氨芐青霉素抗性基因質粒只具有氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌不具有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性積基因的大腸桿菌完全培養基第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日培養檢測含重組質粒的大腸桿菌含有氨芐青霉素的完全培養基含有四環素的完全培養基（大腸桿菌內含有氨芐青霉素抗性基因，不含有四環素抗性基因）只具有氨芐青霉素抗性基因農桿菌不存活存活證明：目的基因已導入質粒培養培養完全培養基

培育出得到能夠發酵產生人類胰島素的工程菌。第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日尋根問底：

將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化：即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體細胞，沒有進行表達載體的構建。

這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因導入了受體細胞。此法目前爭議頗多，嚴格來說不算基因工程。第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日資料:

科學家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。

然后在插入抗蟲基因的質粒中插入抗蟲基因啟動子，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入抗蟲基因終止子，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。

資料證明：載體構建組成要完整第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日三、將目的基因導入受體細胞1.轉化：

目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的工程2.常見轉化方法：（1）將目的基因導入微生物細胞——感受態細胞法。①農桿菌轉化法：雙子葉植物和裸子植物。（2）將目的基因導入植物細胞③基因槍法：單子葉植物。②花粉管通道法：雙子葉植物。顯微注射法。（3）將目的基因導入動物細胞第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日③常用法：②常用菌：①微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態細胞Ca2+處理大腸桿菌感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA___感受態細胞法：（1）將目的基因導入微生物細胞第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日例：第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日

若通過基因過程生產人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？

不可以，糖蛋白上的糖鏈是在內質網和高爾基體上加工完成，而內質網和高爾基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含這兩種細胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎?可以，酵母菌為真核生物（真菌類）。第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日①特點:

農桿菌轉化法：（2）將目的基因導入植物細胞能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物沒有感染能力②過程：Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上③適用生物：雙子葉植物、祼子植物。第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNATi質粒蘇云金桿菌構建表達載體Bt毒素蛋白基因

蘇云金桿菌DNA連接酶

T-DNA(可轉移-DNA)

知識拓展農桿菌轉化法的過程：第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日培養培養導入含目的基因的重組Ti質粒導入農桿菌含有氨芐青霉素的完全培養基不能存活Ca2+

處理細胞形成感受態細胞檢測農桿菌農桿菌（培養不具有氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性積基因的農桿菌）具有氨芐青霉素抗性基因的農桿菌農桿菌不具有氨芐青霉素抗性基因的農桿菌完全培養基含有氨芐青霉素的完全培養基農桿菌證明：目的基因已導入存活第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日脫分化組織培養脫分化農桿菌導入植物細胞通過組織培養產生新個體再分化移植個體生物學水平的鑒定如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達導入植物細胞組織培養第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日花粉管通道法：將目的基因導入植物細胞①操作方法：②特點：

在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞十分簡便經濟③例：轉基因抗蟲棉第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日基因槍法：

利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法①操作方法：②金屬粒：將目的基因導入單子葉植物細胞

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日①細胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（3）將目的基因導入動物細胞發育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養成早期胚胎顯微注射取受精卵提純含目的基因表達載體受精卵第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日四目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功

導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組

DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。

目的基因進入受體細胞后，是否都能穩定維持和表達？不一定，需要檢測1.檢測方法：分子雜交技術：（1）DNA分子與DNA分子的之間雜交（2）DNA分子與RNA分子的之間雜交（3）蛋白質分子（抗原與抗體）之間雜交2.個體生物學水平的鑒定：抗蟲、抗病結種實驗，活性比較實驗第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1.檢測轉基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術變性變性第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日變性方法——DNA分子雜交技術（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA探針15N15N轉基因生物的mRNA14N14N第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質

出現雜交帶脫分化組織培養證明：提取蛋白質與Bt毒素蛋白質一樣第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。2.鑒定——個體生物學水平的鑒定（1）多細胞個體抗蟲、抗病結種實驗，活性比較實驗第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日

不能，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。第41頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日無表達產物無表達產物有表達產物無表達產物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產物。淘汰無表達產物的菌落，保留有表達產物的進一步培養、研究。（2）單細胞生物第42頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日1、有關基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內切酶A課堂練習第43頁，共48頁，2023年，2月20日，星期日2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細胞中提取④利用PCR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D課堂練習第44頁，共48頁，20