抗細菌轉基因工程課程資料演示文稿當前1頁，總共29頁。（優選）抗細菌轉基因工程課程資料當前2頁，總共29頁。病菌特點該病菌屬黃單胞桿菌屬細菌,生長最適溫28-30°C。低于16°C基本不發病。細條病的發生初侵染源主要有稻種、稻草和自生稻帶菌,但也不排除野生稻、李氏禾的交叉傳染。病原菌主要從傷口侵入,菌膿可借風、雨、露等傳播后進行再侵染。高溫高濕等有利于病害發生。臺風暴雨造成傷口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水過深加重發病。當前3頁，總共29頁。水稻細條病的發病特點

危害水稻的主要特點:主要侵害水稻葉片,病斑初呈暗綠色水橫狀半透明小斑點,后逐漸沿葉脈方向擴展,成黃褐色,干結后呈黃色樹膠狀小粒,形如虛線,不易脫落。發病嚴iR吋,條斑融合成不規則的黃褐色至枯白色大斑塊,外觀與白葉枯病有些相似,但對光觀察,病斑呈半透明狀。病害流行時,葉片卷曲,完全呈一片白色。該病在水稻生長前期、后期都易感染,苗期癥狀較白葉枯病明顯;病害嚴重時能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能夠抽穗結實,但批谷增多,千粒重降低。一般年份可減產10%-20%,在氣候條件沾發病嚴重時達40%。當前4頁，總共29頁。Rxo1基因來源Rxo1基因是來自玉米的一個抗玉米細菌性條斑病的寄主抗性基因，將其轉入水稻后轉基因水稻中接種細菌性條斑病病原菌，在接種點處表現典型的HR表型，證實該基因為一重要的非寄主抗性基因。當前5頁，總共29頁。Rxo1基因定位Rxo1基因CDS序列全長（從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG）為2718bp。與許多R基因一樣，該基因編碼的產物是NBS-LRR結構的抗病蛋白（GenBank登錄號為AAX31149.1），其蛋白質序列為905aa。根據SMART數據庫軟件掃描該蛋白的domains、repeats、motifs，找到一個從4-18位點的lowcompositionalcomplexity：IAVLLVLKKIAIALA及一個位于118-147的coiledcoilregion（LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外還預測到了37個其余結構（如UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP及LRR_SD22等），但是其顯著性未達到極顯著的閾值。Sanger的分析則找到3個Pfam-Amatchs，其中顯著的一個是NB-ARC結構：envelope范圍是183-470；比對結果的范圍則是185-467；HMM范圍為3-282；另有兩個非顯著的4個copy的LRR結構。當前6頁，總共29頁。基因Rxo1的雙右邊界雙元載體的構建1.1菌株和載體含有9kbRxo1基因的pCAMBIA1305-1Rxo1質粒由美國堪薩斯州立大學ScotH.Hulbert博士提供。pCAMBIA1305-1質粒是由澳大利亞CAMBIA研究中心構建的含有35S啟動子和細菌卡那霉素抗性基因的雙元載體。采用的農桿菌菌株為EHA105。當前7頁，總共29頁。

（1）美國Kansas州立大學的ScotH.Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1質粒，其中

攜帶有外源目的基因Rxol;

pCAMBIA1305-1質粒當前8頁，總共29頁。

（2）澳大利亞CSIROPlantIndustry的MUpadhyaha博士提供雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6。該載體用于轉接Rxol基因并將重組體轉化到農桿菌中進行后續轉基因:雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6結構圖及可能產生的3種TDNA類型(3)農桿菌菌株為LBA4404;(4)大腸桿菌菌株為DHSa;當前9頁，總共29頁。1.2雙右邊界雙元載體的構建1.感受態細胞的制備和轉化2.雙右邊界雙元載體構建（1）目的基因和載體的酶切連接將攜帶Rxol基因的載體pCAMBIA1305-1用限制性內切酶SacI(AGTVACT),NgoMN(GVCCGGC)進行消化，同時，用限制性內切酶XmaI(CVCCGGG)和HpaI(GTTVAAC)消化載體pMNDRBBin6。將酶切后得到的目的基因片斷和雙元載體用T4噬菌體連接酶連接，連接產物轉化至大腸桿菌。當前10頁，總共29頁。質粒pCAMBIA1305-1-Rxol經內切酶SacI和NgoMIV酶切，得到大小為8.Skb的Rxol目的基因片斷(圖A)，載體pMNDRBBin6經HpaI和XmaI酶切，得到大小為12.3kb的線性化雙右邊界載體(圖B)

A:SacI和NgoMN酶切pCAMBIAI305-I-Rxol;B:HpaI和XmaI酶切pMNDRBBin6;I:pCAMBIA1305-1-Rxol;2:pMNDRBBin6;M:250byDNAMarker.當前11頁，總共29頁。(2)陽性克隆篩選將過夜連接產物轉化大腸桿菌，在LB固體培養基(含SOmg/L壯觀霉素)上涂布37℃培養，挑取轉化子單克隆于LB培養基(含SOmg幾壯觀霉素)中振蕩培養Sh;提取轉化子質粒進行擴增，使用引物Rxol-F(5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3’)和Rxol-R(5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’)篩選獲得陽性克隆;篩選出1個轉化子，其特異性擴增片段與1.45kb目的基因片段Rxol大小相符。提取該克隆質粒DNA進行PCR擴增，擴增片段大小與陽性對照pCAMBIA1305-1-Rxol相同，將產物回收純化連接到pMD20-T上測序，與目的基因序列比對相同，表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6載體中。當前12頁，總共29頁。1M2341:陽性對照pCAMBIA1305-1-itcol;M:1kbDNAlandderMarker;2:陰性對照pMNDRBBin6質粒;3:陽性克隆PCR擴增;4:陽性克隆的質粒PCR擴增;M:1kbDNAladdermarker.------1.45kb當前13頁，總共29頁。(2)對整合了Rxol基因的pMNDRBBin6載體使用HpaI和XmaI進行雙酶切，應得到大小為

20.875kb的片段。該陽性克隆的質粒經酶切后產生1條帶約為20kb(圖2.5)，與目的基因片段和pMNDRBBin6載體的長度之和相等記為pMNDRBBin6-Rxola

1M—l0kb1:質粒;2:Marker.當前14頁，總共29頁。(3)pMNDRBBin6-Rxol經EcoRI酶切后產生4個片段，大小分別為9378bp,8576bp,1632bp和1268bp(9378bp和8576bp片段長度相近，圖中合為一條粗帶)(圖2.6A);SacI酶切產生5個片段，大小分別為8525bp,5194bp,2683bp,1763bp和1528bp(圖2.6B)

圖2.6陽性克隆質粒的EcoRICA)和SacI(B)酶切圖譜.1:質粒;Ml:250byDNAladdermaker;M2:1kbDNAladdermarker.上述酶切結果與PremierPrimer5.0分析的理論酶切片段大小相符，表明Rxol基因整合到了雙邊界載體中，且位于TDNA相鄰的左右邊界之間。當前15頁，總共29頁。(3)陽性克隆酶切鑒定和PCR擴增(4)載體序列分析(5)保存陽性克隆，以備后續遺傳轉化工作。當前16頁，總共29頁。水稻的遺傳轉化

將處理好的種子誘導培養基MS（含100mL/LMS大量元素混合液上，26℃培養箱中暗培養約30天。（1）繼代培養將上述誘導的質地緊密、色澤鮮艷的胚性愈傷組織在超凈臺中用鑷子剝離，轉移到繼代培養基中（MS培養基，如上），2周后選擇原胚性愈傷組織分化出來的質地均勻、顆粒較小、色澤良好的愈傷顆粒繼代一次，共繼代2次。當前17頁，總共29頁。（2）農桿菌活化將超低溫保存的農桿菌劃線于含50mg/L卡那霉素的YEB培養基上，28℃培養箱中培養24h；挑取單菌落，接于2mL含有50mg/L卡那霉素的YEB液體培養基中，28℃搖床中振蕩培養約36小時；用移液槍吸取1mL新鮮菌液接于50mL含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養基中，搖菌至OD600為；將活化好的農桿菌離心，4000rpm，10min，去上清后重懸于AAM-As（100含mL/LAAM大量元素、5mL/L上述鐵鹽、0.1mg/LVB1、0.6mg/LVB6、0.5mg/L煙酸、0.75mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.5g//L酪蛋白、68.5g/L蔗糖及36g/L葡萄糖，調節PH至5.2，滅菌后冷卻至約60℃的培養基中加入1mL10mmol/L的乙酰丁香酮）液體培養基中，28℃，200rpm振搖3-4小時，用分光光度計調節OD600為，即可用于分裝、侵染愈傷組織。當前18頁，總共29頁。（3）侵染、共培養與篩選材料為在繼代培養基上生長4-5天的愈傷組織，將愈傷組織轉移到滅菌濾紙上吸濕20min后轉移到調好濃度的菌液中；搖床中緩慢搖晃20-30min；倒掉菌液，于滅菌濾紙上吸棄多于菌液；取出愈傷，播于鋪有一層濾紙的共培養培養基（PH為5.2的MS培養基）中，20℃生化培養箱中恒溫培養2-3天。當共培養的愈傷周圍出現明顯的菌體時，將其轉移至滅菌濾紙上，吸去表面菌體后用含有150mg/L頭孢噻奎鈉和200mg/L羧芐青霉素的無菌水中，100rpm振蕩30min，重復3次；將洗過的愈傷轉移至滅菌濾紙上，吸取多于水分；將愈傷接入篩選培養基（含有150mg/L頭孢噻奎鈉和200mg/L羧芐青霉素及50mg/L潮霉素）中，26℃避光篩選15-20天后將未變黑的愈傷轉移到新的篩選培養基，重復2次。當前19頁，總共29頁。（4）植株再生將篩選培養基上的抗性愈傷組織介入預分化培養基（含有N6大量、MS微量、鐵鹽、1mg煙酸、10mgVB1、1mgVB6、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g甘氨酸、0.5g脯氨酸、30g蔗糖、3g植物凝膠、2.2mgNAA、2.5mg6-BA，PH為5.8）上，26℃暗培養7天后在12小時光照、12小時黑暗的條件下培養7天。將預分化的抗性愈傷組織接入鋪有無菌濾紙的培養皿中，干燥處理3小時后轉移到分化培養基（每升含有N6大量、MS微量、鐵鹽、1mg煙酸、10mgVB1mgVB6、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g甘氨酸、0.5g脯氨酸、30g麥芽糖、3g植物凝膠、0.5mgNAA、1.5mg6-BA，PH為5.8）上，在26℃環境中12小時光照及12小時避光的條件下，培養至愈傷變綠，長出少量根，且分化出莖葉。當前20頁，總共29頁。（5）生根培養當分化的小苗生長到4-5cm時，將其轉移到生根培養基（每升中含25mLMS大量元素、5mLMS微量元素混合液、5mL鐵鹽、30g蔗糖、3g植物凝膠、0.1mg/LNAA、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g谷氨酰胺及0.5g脯氨酸，調節PH至5.8）上，上述溫度和光照的條件下繼續培養30天左右。當前21頁，總共29頁。（6）壯苗與煉苗

將小苗經7天溫室煉苗后，轉移到人工氣候室水培20天，再轉移至隔離的網室中種植。當前22頁，總共29頁。（7）轉基因后代的表型檢測與分子檢測當植株生長到分蘗盛期時，用針刺法接種毒性Xoc小種，分別在第3天、第5天、第7天及第10天觀察記錄接種點的反應表型。DNA提取：CTAB法提取轉移至網室種植的基因工程苗的基因組DNA（經液氮速凍后研磨的約0.1g葉片粉末中加入400μLCTAB提取液；65℃水浴40分鐘，期間搖晃混勻2次；8000rpm離心10分鐘后吸取上清；上清中加入等體積的24:1氯仿：異戊醇，搖床上100rpm5min；10000rp離心10分鐘；吸取轉移上清至新管，加入2/3體積預冷的異丙醇后混勻；-20℃下放置30min以上；10,000rpm離心5min，棄廢液；用酒精洗兩遍，室溫下風干，加入200μL溶解DNA;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量）。當前23頁，總共29頁。基因檢測為了檢測所轉基因的拷貝數，采用了Nothern雜交的方法（雜交步驟見地高辛試劑盒說明）：提取經PCR檢測為陽性的植株及受體對照的DNA，用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后于1%瓊脂糖凝膠電泳中低電壓條件下過夜。雜交操作參照試劑盒所述方法。

所用的探針為Rxo1-pCAMBIA1305-1質粒為模板Rxo1-1F和Rxo1-1R為引物擴增出的約1.45kb的Rxo1片段。當前24頁，總共29頁。

細菌性條斑病菌株的分離培養與接種鑒定

菌株分離：以從田間取具有細條病表型（水浸狀條斑，有菌膿）且無其余病害（特別是白葉枯病）導致的癥狀的葉片為標本，經75%酒精表面消毒10s，放入滅菌水中清洗2min，重復3次；在滅菌水中剪碎，放置3分鐘；用滅菌接種針蘸取游離有病原細菌的處理液，在PSA培養基（300g土豆煮出的水中加入5g蛋白胨、15g蔗糖、0.5g硝酸鈣、0.78g磷酸氫二鈉及15g瓊脂粉，定容至1000mL）上劃線；置于28℃培養箱中培養2-3天；挑取從形態與外觀上看為黃單胞菌的單菌落，擴繁培養，并經接種鑒定為正確的菌株在20%甘油的條件下置于-70℃中保存。菌體培養與接種：用接種針蘸取保存菌株的菌液，在上述培養基中劃線培養2-3天；挑取單菌落擴繁培養2天；用無菌水將菌體洗下，混勻成濃度為108cells/mL；在吸滿菌液的海綿上用大頭針針刺接種不同水稻葉片；接種后3-15天內連續觀察和記錄表型。當前25頁，總共29頁。當前2