醫學分子生物學MolecularBiology分子生物學:是從分子水平研究生命現象、生命的本質、生命活動及其規律的科學。醫學分子生物學:是從分子水平研究人體在正常和疾病狀態下生命活動及其規律的一門科學。它主要研究人體生物大分子和大分子體系的結構、功能、相互作用及其同疾病發生、發展的關系。醫學分子生物學(供8年制及7年制臨床醫學等專業用)馮作化主編人民衛生出版社(2005)2.醫學分子生物學(供研究生用)(全國高等醫藥院校教材)查錫良主編人民衛生出版社(2003,2006)參考教材主要內容核酸的結構與功能基因組學、遺傳信息傳遞（DNA復制，RNA轉錄，蛋白質合成）基因表達調控（原核生物基因表達調控，真核生物基因表達調控）分子生物學基本技術（雜交，PCR,DNA測序，基因克隆及工具酶基因診斷與基因治療基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是RNA和蛋白質相關遺傳信息的基本存在形式。大部分生物中構成基因的核酸是DNA,少數生物（如RNA病毒）是RNA。基因的現代分子生物學概念DNA和RNA的化學組成元素組成

C、H、

O、

N、

P（9-10%）分子組成

-堿基：嘌呤堿、

嘧啶堿

-戊糖：核糖、

脫氧核糖

-磷酸嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)堿基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)核酸的結構StructureofNucleicAcid一、核酸的一級結構（primarystructure）

定義：核酸中核苷酸的排列順序。組成DNA分子的脫氧核糖核苷酸(dAMP,dGMP,dTMP,dCMP)的排列順序。組成RNA分子的核糖核苷酸(AMP,GMP,UMP,CMP)的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。5′端3′端核苷酸之間以3,5-磷酸二酯鍵(phosphoesterbond)連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA書寫方法

堿基戊糖磷酸

堿基戊糖磷酸

嘌呤嘧啶DNAAGCT

脫氧核糖磷酸RNA AGCU

核糖磷酸N9N1C1‘

核苷糖苷鍵核苷酸（多為5’核苷酸）磷酸二酯鍵兩種核酸的比較DNA的結構一、DNA的一級結構

四種脫氧核糖核苷酸或四種堿基的排列順序稱為DNA的一級結構。二、DNA的二級結構（Secondarystructure）

---雙螺旋結構(DoublehelixofDNA)

JamesWatsonandFrancisCrickproposedadoublehelixmodelofDNAin1953.DNA雙螺旋結構模型要點

1.兩條鏈反向平行(antiparallel)，圍繞同一中心軸構成右手雙螺旋(doublehelix)。螺旋直徑2nm，表面有大溝和小溝。2.磷酸-脫氧核糖骨架位于螺旋外側，堿基垂直于螺旋軸而伸入內側。每圈螺旋含10個堿基對

(basepairs,bp)，螺距為3.4nm。大溝小溝3.兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，A對T有兩個氫鍵，C對G有三個氫鍵，這種A-T、C-G配對的規律，稱為堿基互補規則。4.維持雙螺旋穩定的因素：橫向為氫鍵，縱向為堿基間的堆積力。DNA雙螺旋結構的多樣性Z型DNAB型DNAA型DNA右手螺旋左手螺旋三、DNA的高級結構（三級結構）

DNA分子在形成雙螺旋結構的基礎上，進一步折疊成超螺旋結構

(supercoil)(原核細胞)，或在蛋白質的參與下，進行精密的包裝(真核細胞)。高度壓縮的DNA分子才能容納于細胞質或細胞核中。原核生物(Prokaryotic)DNA的高級結構

環狀雙螺旋分子，進一步盤繞形成類核。超螺旋結構(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構。

正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同。負超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反。自然界的閉合雙鏈DNA主要以負超螺旋形式存在。意義DNA超螺旋結構整體或局部的拓撲學變化及其調控對于DNA復制和RNA轉錄過程具有關鍵作用。DNA在真核生物(Eukaryotic)細胞核內的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質構成，其基本單位是核小體(nucleosome)。核小體的組成DNA：約200bp組蛋白：H1H2A，H2BH3H4(約60bp)組蛋白H1八聚體核心組蛋白串珠狀核小體結構真核生物染色體DNA組裝DNA的功能：是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復制和轉錄的模板。它是生命遺傳的物質基礎，也是個體生命活動的信息基礎。基因從結構上定義，是指DNA特定區段，其中核苷酸排列順序決定了基因的功能。

DNA攜帶遺傳信息結構信息

DNA→RNA→蛋白質調控信息特定的DNA區段與蛋白質分子的識別、結合、控制基因復制和基因表達等有關。

基因的結構特點結構基因定義：在基因片段中，貯存著一個特定的轉錄RNA分子的DNA序列，這段序列決定該RNA分子的一級結構，就稱為結構基因。

不同生物結構基因特點1.原核生物結構基因的特點結構基因在DNA上是連續的2.真核生物結構基因的特點結構基因在DNA上是不連續的（斷裂基因）3.病毒結構基因的特點有的是連續的，有的是間斷的，取決于其能夠侵染宿主。外顯子（exon)

結構基因中在成熟RNA分子中保留的相對應的序列內含子(intron)

是指RNA分子剪接時刪除部分相對應的結構基因序列

基因轉錄調控序列定義：與轉錄相關的、結構基因以外的序列原核生物基因的轉錄調控序列1.啟動子（promoter)

是RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列，位于結構基因轉錄起始點的上游。啟動子本身并不被轉錄。2.終止子是結構基因3‘段下游的一段DNA序列，其中有GC富集區組成的反向重復序列，轉錄后在RNA分子中形成特殊的結構以終止RNA鏈的延伸。3.操縱元件（operator)

操縱元件是被阻遏蛋白識別與結合的一小段DNA序列（阻遏蛋白與操縱元件結合后抑制下游結構基因的轉錄）

4.正調控結合蛋白結合位點

在弱啟動子附近有一些特殊的DNA序列，轉錄激活蛋白可以識別并結合這種DNA序列，該蛋白可與RNA聚合酶作用，促進轉錄的啟動。這種DNA序列就是正調控蛋白結合位點。

真核生物的轉錄調控序列

與轉錄調控有關的DNA序列成為順式作用元件（cis-actingelement),包括啟動子、上游啟動子元件、增強子、加尾信號和一些反應元件等。啟動子

RNA聚合酶特異性識別和結合的DNA序列，多數位于結構基因轉錄起始點的上游，啟動子本身不被轉錄，但有些啟動子（如tRNA啟動子）可以位于轉錄起始點的下游，這些DNA序列可以被轉錄。2.上游啟動子元件指TATA盒上游的一些特定的DNA序列（1）與TATA盒共同組成啟動子（2）是反式作用因子（轉錄激活蛋白）識別與結合的位點常見的上游啟動子元件CAAT盒：含有5’GGNCAATCT3’-80bp~-90bpCACA盒：含有5’GCCACACCC3’核心序列

-80bp~-90bp

（大多數真核生物基因具有）GC盒：含有5’CCGCC3’核心序列

-70bp和-120bp

（組成型基因具有）3.增強子（enhance）是一種較短的DNA序列，能夠被反式作用因子識別與結合。與增強子元件結合后能夠增強鄰近基因轉錄。位于轉錄起始點上游-100～

-300bp處。4.反應元件一類能介導基因對細胞外的某種信號產生反應的特異的DNA序列。特點：具有較短的保守序列通常位于啟動子附近，啟動子內或增強子區域5.poly(A)信號真核生物基因除了調控轉錄起始的序列外，在結構基因的3’端下游還有加尾信號，由AATAA序列和GT豐富區，或T豐富區組成。作用：終止mRNA轉錄和為其加上poly(A)尾。不同生物基因的基本結構特點原核生物基因的基本結構

5’-啟動子-結構基因-轉錄終止子-3’操縱子（operon)

功能上相關聯的數個結構基因串聯在一起，由一套轉錄調控序列控制其轉錄，構成的基因表達單位。2.真核生物基因的基本結構組成一個結構基因+轉錄調控序列特點

mRNA多是單順反子（monocistron)例外

rRNA基因結構是多順反子3.病毒基因的基本結構特點很小（和真核基因相比）一般沒有內含子調控序列較少有不規則基因不同生物體的基因組物種總DNA（kbp）染色體數基因數大腸桿菌463914405酵母12068166200線蟲9700012/1119000擬南芥1250001025500果蠅1800001813600水稻4800002457000小鼠25000004030000～35000人32000004630000～35000玉米300000020雞210000078DNA是生物遺傳信息的載體，并為基因復制和轉錄提供了模板。它是生命遺傳的物質基礎，也是個體生命活動的信息基礎。DNA具有高度穩定性，用來保持生物體系遺傳的相對穩定性。同時，DNA又表現出高度復雜性的特點，它可以發生各種重組和突變，適應環境的變遷，為自然選擇提供機會。

RNA的結構與功能StructureandFunctionofRNARNA是DNA的轉錄產物

RNA通常以單鏈線性形式存在，但是可以通過鏈內的堿基互補配對形成局部的雙螺旋結構，進而形成三級結構。與DNA相比，RNA的種類、大小、結構以及穩定性表現出了多樣化，這與它們的功能多樣化密切相關。RNA特點真核細胞內主要RNA的種類和功能種類細胞定位功能信使RNAmessengerRNA(mRNA)細胞核、細胞質、線粒體蛋白質的合成模板非均一核RNAheterogeneousnuclearRNA(hnRNA)細胞核成熟mRNA的前體轉運RNA

transferRNA(tRNA)細胞核、細胞質、線粒體轉運氨基酸核糖體RNA

ribosomalRNA(rRNA)細胞核、細胞質、線粒體構成核糖體非編碼小RNAsmallnon-codingRNA(sncRNA)細胞核、細胞質參與hnRNA的剪接和轉運、rRNA加工、基因表達調控等一、信使RNA含有氨基酸編碼序列

-------作為蛋白質合成的模板hnRNA內含子(intron)mRNAmRNA成熟過程

外顯子(exon)*mRNA結構特點1.真核mRNA的5′末端在轉錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結構：m7GpppNm-。2.真核mRNA的3′末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結構，稱為多聚A尾。

真核mRNA的5-末端7-甲基鳥嘌呤核苷帽狀結構及核糖甲基化mRNA核內向胞質的轉移mRNA的穩定性維系翻譯起始的調控帽子結構和多聚A尾的功能DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞mRNA含有氨基酸密碼子

mRNA的功能是轉錄核內編碼蛋白質信息的DNA堿基排列順序，并攜帶至細胞質，指導蛋白質合成。mRNA分子從5-末端的第一個AUG(起始密碼子)開始，每3個核苷酸為一組，決定肽鏈上一個氨基酸，稱為三聯體密碼或密碼子(codon)。位于起始密碼子和終止密碼子之間的核苷酸序列稱為開放閱讀框(openreadingframe，ORF)，可讀框內的核苷酸序列決定了多肽鏈的氨基酸序列。一條完整的mRNA包括5-非編碼區、編碼區和3-非編碼區。編碼區包括起始密碼子、編碼氨基酸的序列和終止密碼子。tRNA的一級結構特點含稀有堿基較多3′末端為-CCA-OH二、轉運RNA(TransferRNA,tRNA)----氨基酸的攜帶者，轉運氨基酸至核糖體，參與蛋白質的合成。（一）

tRNA分子含有稀有堿基含10%~20%稀有堿基，如DHU3末端為—CCA-OH5末端大多數為G

具有TC二、轉運RNA含有接納氨基酸和mRNA識別序列氨基酸臂額外環（二）tRNA有“三葉草”樣二級結構和倒“L”形三級結構ＴψＣ環氨基酸臂DHU環反密碼環氨基酸臂額外環有些氨基酸只有一種tRNA作為載體，而另外的一些氨基酸則需要幾種tRNA作為載體。

（三）tRNA有識別mRNA密碼的反密碼子*tRNA的功能活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。*rRNA的結構三、核蛋白體RNA(RibosomalRNA,rRNA)*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質生物合成的場所。*rRNA的種類（根據沉降系數）

真核生物

5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA

原核生物

5SrRNA23SrRNA16SrRNA（一）原核、真核rRNA分子質量不同核糖體(ribosomes)的組成原核生物真核生物小亞基30S40SrRNA16S18S蛋白質21種33種大亞基50S60SrRNA23S5S28S5.8S5S蛋白質33種49種核糖體70S80S核糖體的組成原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物（以小鼠肝為例）小亞基30S40SrRNA16S1542個核苷酸18S1874個核苷酸蛋白質21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個核苷酸120個核苷酸28S5.85S5S4718個核苷酸160個核苷酸120個核苷酸蛋白質31種占總重量的30%49種占總重量的35%18SrRNA的二級結構

rRNA與核糖體蛋白質共同構成核糖體，是蛋白質生物合成的場所：為肽鏈合成所需要的mRNA、tRNA、多種蛋白因子提供了相互結合的位點和相互作用的空間環境。（三）rRNA參與組成的核糖體是蛋白質翻譯的場所四、非信使小RNA具有多樣性除了上述三種RNA外，細胞內存在的許多其他種類的小分子RNA，統稱為非信使小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。

snmRNAs非編碼RNA(non-codingRNA)專指那些具有調節作用的小RNA，如siRNA、miRNA等。snmRNAs的種類核內小RNA（smallnuclearRNA，snRNA）核仁小RNA（smallnucleolarRNA，snoRNA）胞質小RNA（smallcytoplasmicRNA，scRNA）催化性小RNA（smallcatalyticRNA）小干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）微RNA（microRNA，miRNA）等在hnRNA和rRNA的轉錄后加工、轉運中發揮作用，有的參與基因表達調控等；是現代生物學研究的新領域。真核細胞內重要的snmRNAs種類英文名稱生物學功能核內小RNAsmallnuclearRNA(snRNA)參與hnRNA剪接，包括U1、U2、U4、U5、U6核仁小RNAsmallnucleolarRNA(snoRNA)參與rRNA核糖C-2’的甲基化胞質小RNAsmallcytoplamsicRNA(scRNA)催化小RNAsmallcatalyticRNARNA剪接，包括核酶等小干擾RNAsmallinterferenceRNA(siRNA)參與轉錄后調節；對外源入侵RNA基因的切割（一）核內小RNA與核糖核蛋白結合共同參與mRNA前體加工snRNA長度（nt）剪接hnRNA的靶位點U1U2U4U5

U6U7165189145115106635-端內含子腺苷酸分支點5端，補充分支點轉酯化反應，3剪接點，使外顯子連接轉酯化反應組蛋白H3前體的mRNA3末端裂解高等真核細胞snRNA的特征

（二）催化性小RNA參與RNA剪接加工

一些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，在RNA合成后的剪接中具有重要作用。這種具有催化作用的小RNA亦被稱為核酶(ribozyme)或催化性RNA(catalyticRNA)。（三）核仁小RNA參與rRNA甲基化修飾（四）小干擾RNA特異阻斷體內同源基因的表達核酸的理化性質ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid核酸的酸堿及溶解度性質核酸為多元酸，具有較強的酸性。可與金屬離子成鹽，不溶于乙醇或異丙醇一、核酸具備多種基本物理化學性質核酸中的糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸、堿和酶水解。（一）核酸可被酸、堿水解（二）核酸是兩性分子堿基可發生互變異構堿基在體液環境中以堿性解離為主核酸分子是酸性化合物（三）核酸溶液具有高分子性質黏滯度：DNA〉RNAdsDNA〉ssDNA沉降系數：溶液中的核酸在離心力場中可下沉。DNA分子經反復盤曲形成超螺旋后，其沉降系數增加，超螺旋松解后其沉降系數減小。（四）核酸具有紫外線吸收特性核酸的紫外吸收（OD260）

單核苷酸〉ssDNA（或RNA）〉dsDNA

腺嘌呤1.DNA或RNA的定量A260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:A260/A280=1.8RNA純品:A260/A280=2.0A260的應用二、核酸變性、復性是很多分子生物學技術操作的基礎定義：核酸的變性（denaturation）指DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂變成單鏈、或RNA局部氫鍵斷裂變成線性單鏈結構的過程（一）核酸變性是雙鏈解離為單鏈的過程方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素以及某些有機溶