YUNNANNDRMALUNIVERSITY本科學生實驗報告姓名王冬梅 學院—生命科學學院專業—應用生物教育—班級08應生A班—實驗課程名稱 指導教師及職稱 —開課學期2010 至—2011 學年—下—學期上課時間 2011年3月? 6月云南師范大學教務處編印實驗三：胡蘿卜細胞的懸浮培養一、實驗目的：了解植物細胞懸浮培養的基本原理，通過實驗掌握植物細胞懸浮培養的方法和技術。并通過實驗練習和鞏固無菌操作技術二、基本原理利用固體瓊脂培養基對植物的離體組織進行培養的方法在植物遺傳實驗中已經得到廣泛的應用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，比如在培養過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養成分、植物組織產生的代謝物質呈現一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質成分可能對培養物產生影響，從而導致植物組織生長發育過程中代謝的改變而利用液體培養基則可以克服這一缺點，當植物的組織在液體培養基中生長時，我們可以通過薄層震蕩培養或向培養基中通氣用以改善培養基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉移到液體培養基中進行培養。在培養過程中不斷進行旋轉震蕩，一般可用100?12Or/min的速度進行。由于液體培養基的旋轉和震蕩，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。在液體培養基中的培養物是混雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團塊，還有接種物的死細胞殘渣。在液體懸浮培養過程中應注意及時進行細胞繼代培養，因為當培養物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。對于多數懸浮培養物來說，細胞在培養到第18?25d時達到最大的密度，此時應進行第一次繼代培養。在繼代培養時，應將較大的細胞團塊和接種物殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細胞懸浮培養體系，就包括愈傷組織的誘導、繼代培養、單細胞分離和懸浮培養。目前這項技術已經廣泛應用于細胞的形態、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經過轉化的植物細胞再經過誘導分化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。三、器材超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、恒溫空氣搖床、鑷子、錐形瓶等。四、操作步驟：胡蘿卜細胞的懸浮培養培養基的配制配方：MS+RT(0.5mg/l)+2,4-D(l)+LH(100)+C(30g/l) PH:5.8胡蘿卜細胞的懸浮培養將前面培養好的胡蘿卜愈傷組織。如下：

挑選增殖良好的轉移到200ml的三角瓶中，瓶內裝有一定量的液體培養基，將三角瓶置于搖床上，轉速100r/min,25°C下光照培養。進行懸浮培養后要不斷進行觀察，由于培養物的繼代培養與培養瓶內培養物的密度及細胞生長速度有關，因此當發現培養瓶中培養物密度較大時，應及時用無菌的吸管吸取部分培養物到一新的50mL培養基中繼續培養。同時還要及時淘汰一些大的組織團塊和黃褐色的壞死組織。一般每隔4?7d就要繼代一次。本次實驗基本成功，但其中也有不足之處，所以需要再接再厲，做得更好。不足之處：經觀察懸浮培養基中的細胞碎片較多，這可能是搖床的速度偏大導致，所以適當降低轉速估計可以降低細胞的碎片。組織培養當中的無菌操作是必須條件，養