生物堿的高效液相色譜分離分析和制備方法,有機化學論文摘要：生物堿是天然產物中藥用活性較好的一類化合物,在分離科學與技術領域,生物堿的分離一直是一個研究熱門和難點問題。近年來,隨著高效液相色譜填料和分離方式方法的發展,生物堿的分離分析和純化制備有了長足的進步。該文主要針對堿性化合物的峰形拖尾問題,綜述了高效液相色譜理論的發展和色譜分離技術的進步,以及近年來新型色譜填料和分離方式方法在生物堿分離分析和純化制備中的應用,并對其前景進行了瞻望。本文關鍵詞語：生物堿;拖尾;制備色譜;正交分離;Abstract：Alkaloidsareaclassofnaturalcompoundswithgoodpharmacologicalproperties.Inthefieldofseparationscienceandtechnology,alkaloidseparationhasalwaysbeenahotanddifficultproblem.Inrecentyears,withthedevelopmentofhighperformanceliquidchromatography(HPLC)materialsandseparationmethods,greatprogressesinalkaloidanalysisandpreparationhavebeenachieved.Inthisarticle,thetheoreticaldevelopmentandtechnologicaladvanceswithrespecttopeaktailingproblemsofbasiccompoundsaresummarized,andtheapplicationsofHPLCinnaturalalkaloidanalysisandpreparationarediscussed.ThefurtherdevelopmentofHPLCseparationonalkaloidsisalsolookedforward.Keyword：alkaloids;peaktailing;preparativeHPLC;orthogonalseparation;生物堿是天然產物中藥用活性和成藥性較好的一類化合物,據統計,美國FDA批準的1000多種小分子藥物中,堿性藥物的比例超過60%[1]。在當前已發現的天然產物中,生物堿在總數上固然只占16%,但在具有重要藥理活性的天然產物中占50%,是天然產物新藥開發中最具潛力的一類化合物[2]。從19世紀初開場,植物化學家就一直致力于生物堿的純化制備,通過溶劑萃取、硅膠柱層析、結晶等植化手段獲得了大量生物堿,并開發出諸多的堿性藥物[2,3,4]。但由于傳統技術的局限,對生物堿分離純化往往收率很低,十分是含量較低的成分極易丟失,還有很多構造類似的生物堿,也由于分離度不夠而無法獲得純品。高效液相色譜是在傳統柱層析基礎上,采用細顆粒的球形硅膠基質鍵合固定相和高壓泵輸液方式發展起來的具有柱效高、分離能力強、重復性好、速度快等系列優點的當代色譜分離方式方法,當前已成為藥物分析、食品科學、生命科學等學科和產業領域不可或缺的重要分析工具[5]。隨著分析型高效液相色譜的普及,制備型高效液相色譜也得到了越來越多的發展[6]。在天然產物領域,制備型高效液相色譜被廣泛應用于黃酮、皂苷、生物堿等成分的純化分離[7,8,9],十分是在構造類似物的分離中起到了重要作用,直接推動了很多新化合物的發現[10,11,12,13,14]。然而相比于其他類型天然產物,生物堿的分離往往會出現峰形拖尾和載樣量十分低的情況,不僅在傳統硅膠柱上死吸附嚴重,在高效制備填料上也仍然是令人頭疼的問題[15,16]。由于峰形拖尾,生物堿往往峰寬較寬,峰高較矮,檢測靈敏度較差,而提高進樣量又會導致色譜峰拖尾加劇,柱效迅速下降,相鄰的成分更易被拖尾峰包裹,這些問題給生物堿的分離分析和純化制備帶來了很多困難。針對像生物堿這樣的堿性化合物的特殊色譜保存行為,研究者們從流動相和固定相上作了一系列探尋求索并獲得了一定進展。本文將主要從堿性化合物的高效液相色譜峰形拖尾的構成機理和相應改善方式方法,以及實際應用,生物堿的分離分析和純化制備進展等方面進行綜述。1、堿性化合物峰形拖尾的內在機理討論在過去幾十年中,很多研究者對堿性化合物的色譜峰拖尾行為展開了研究并提出了相應的觀點,華而不實主要有硅醇基理論、帶電溶質互相排擠理論和多位點吸附理論。1.1、硅醇基理論硅醇基理論[17]是最早用于解釋堿性化合物在硅膠基質固定相上拖尾現象的理論。該理論以為,硅膠基質外表殘留的酸性硅醇基與堿性化合物之間的離子交換作用,是導致堿性化合物拖尾的主要原因。在C18等反相填料的鍵合經過中,由于空間位阻的存在,硅醇基往往不能完全反響,即便采用短鏈硅烷試劑進行封尾,仍有大量硅醇基未反響[15]。十分是在早期色譜填料制備經過中,使用了TypeA類硅膠基質,存在較多的金屬離子殘留,會進一步激發硅醇基的酸性,進而導致堿性化合物拖尾[18]。為此,色譜填料和色譜柱生產廠商通過改良球形硅膠基質的生產工藝,并發展了多種封尾技術[19,20]。隨著高純硅膠(純度99.99%)和封尾技術的普遍應用,硅醇基的活性大大降低,如Neue等[21]以鋰離子(Li+)的保存為指標對Waters公司的多種硅膠基質及其C18鍵合色譜柱的硅醇基酸性進行評價時發現,在pH3.0～7.0范圍內,高純硅膠基質反相色譜柱(SymmertryC18和XTerraMSC18)對鋰離子均無保存,講明其陽離子交換作用在酸性條件下幾乎能夠忽略。但在實際應用中,即便在這里類高純硅膠色譜柱上開發堿性化合物的分析方式方法,仍經常需在流動相中添加磷酸鹽等緩沖鹽或其他試劑來改善峰形。另外,研究發如今不含硅醇基的聚合物色譜柱上,離子化堿性化合物仍然出現了拖尾和易過載現象[22](圖1),而且在硅膠基質的反相色譜柱上,強酸性化合物也會表現出與堿性化合物類似的峰形拖尾和展寬現象[23],表示清楚生物堿的峰形拖尾顯然還存在硅醇基以外的因素。圖1中性化合物和堿性化合物的典型色譜載樣行為差異[22]Fig.1DistinctoverloadingbehaviorsofneutralandbasiccompoundsontypicalRPLC[22]1.2、帶電溶質互相排擠理論為進一步探究生物堿拖尾的機理,研究者們提出了帶電溶質互相排擠理論[23]并采用單分子層Langmuir吸附模型作進一步驗證和闡述[24]。該理論以為,相比于中性化合物,帶有同種電荷的溶質在固定相外表存在互相排擠作用,使得固定相外表能夠被吸附的位點數量減少,進而導致了其載樣量的下降。這種理論能夠在一定程度上解釋堿性化合物在聚合物色譜柱的色譜保存行為,以及強酸性化合物在硅膠基質反相色譜保存行為。根據該理論,樣品在非離子形態時具有最高的載樣量,而在離子狀態時載樣量會下降。然而,此前的熱力學研究表示清楚離子化合物與中性化合物的總吸附容量接近[25],這與單分子層的Langmuir模型矛盾,因而,離子型化合物的拖尾還存在其他因素。1.3、多位點吸附理論多位點吸附模型[26,27]是更準確嚴謹的解釋離子型化合物拖尾的理論,相比于帶電溶質互相排擠理論的單分子層吸附模型,該理論以為固定相外表還存在其他吸附能量不同的位點,這一方面解釋了此前離子型化合物與中性化合物熱力學容量相近的結果,另一方面提供了離子型化合物的動力學解釋。該理論的主要觀點是,堿性化合物的保存是多種吸附能量不同位點的共同作用結果,堿性化合物總是先占據數量較少的高能吸附位點,當高能吸附位點飽和后,才會去占據數量較少的低能吸附位點。相比于中性化合物,離子型化合物間的高低能位點間的能量差更大,由此可能導致離子型化合物傳質均一性較差,并最終反映在色譜分離上更易出現過載和拖尾的現象。這些不同能量的吸附位點與他們所處的化學環境相關,華而不實少量的高能位點位于C18鏈內層,而大量的低能位點存在于C18鏈表層。該理論通過吸附等溫線的測定,推導出了適宜的吸附模型,并從大量的色譜柱案例得到了驗證,較為可靠,但到底為何會產生這種多位點的吸附,當前仍未有明確的結論,主要歸因于材料外表的不均一性[28]。該理論主要由Guichon等[26,27,28]提出并反復驗證,但國內關注者較少,國際上也較少有人據此提出相應的解決方案。根據該理論,降低生物堿對高能位點的吸附,是改善拖尾的一種手段。綜上所述,堿性化合物在硅膠基質色譜柱上的特殊保存行為機理存在較復雜的因素,相關的機理討論仍在不斷完善中。2、改善生物堿拖尾的方式方法基于上述堿性化合物峰形拖尾問題的機理討論,研究者們從流動相和固定相兩方面提出了一系列改善措施,這些方式方法同樣在生物堿的分離分析和純化制備中得到了很好的應用。2.1、流動相方面為減少硅醇基和堿性化合物的離子交換作用,能夠使用低pH值流動相以抑制硅醇基的電離,或使用高pH值流動相抑制生物堿的電離[29];可以參加有機胺改性劑(如三乙胺[30])競爭占據離子化硅醇基,進而阻斷堿性化合物與硅醇基間的互相作用。除此之外,還可通過添加高濃度緩沖鹽[31,32]、離子對試劑[33]或離子液體[34],以緩和溶質間的互相排擠,減少溶質與硅羥基的互相作用。這些添加劑的使用對分析水平上峰形的改善起到了一定的作用,但高濃度緩沖鹽、離子對試劑和離子液體會導致更長的柱平衡和柱清洗時間,增大基線噪音,還會腐蝕儀器,影響數據質量。更重要的是,單純改變流動相條件,并不能完全解決制備水平上的峰形拖尾問題,如低pH值流動相固然抑制了硅醇基的電離,但會促進生物堿的電離,當載樣量增加時,峰形仍然會發生拖尾;除此之外,高pH值流動相雖可抑制生物堿的電離,但會造成硅膠的溶解,因而還需配合耐堿性的色譜柱。2.2、固定相方面通過改良固定相構造來克制堿性化合物拖尾是近些年研究的熱門。隨著硅膠制備工藝的發展,基于高純硅膠的色譜柱逐步占據了主流。利用這類低硅醇基活性的色譜柱對堿性化合物進行分析,峰形優于早期硅膠。除此之外,通過一定程度的封尾或極性基團修飾,還能夠進一步屏蔽活性硅醇基,進而獲得更好的峰形。這類色譜柱的代表如Waters公司的SymmetryShieldRP18等。然而,這一類色譜柱通常只能在分析水平獲得較好的峰形,載樣量有限,且其pH值耐受范圍有限。為知足堿性化合物在高pH值條件下分析的需求,各色譜柱廠家發展了一些更為先進的制造技術。如Agilent公司采用雙封尾技術,研制了ZorbaxExtendC18色譜柱,可在堿性條件下較好地屏蔽硅醇基;Merck公司的LichrospherRP-selectB色譜柱,采用高密度鍵合方式,降低硅醇基暴露在流動相中的幾率;迪馬公司的SpursilC18色譜柱,在硅膠制造的最后階段,在其外表移植了一層硅膠-有機層,進而保衛了內部的硅醇基,可以在堿性條件下使用。除此之外,Waters公司還提出了有機-無機雜化硅膠的概念,并推出了系列色譜柱,顯著延長了色譜柱在堿性條件下的使用壽命,代表性色譜柱如XBridge系列[35,36]。需要指出的是,高pH值耐受色譜柱的發展,固然一定程度知足了弱堿性及中等堿性化合物的分離和制備,但由于堿性非常強的化合物(如季銨型生物堿等)即便在堿性條件下仍可保持正離子狀態,而硅醇基由于在堿性條件下電離出負電荷,進而使生物堿與硅醇基間的離子交換作用加劇,導致堿性化合物的峰形反而更差[37]。圖2XChargeC18色譜柱的外表化學構造[39]Fig.2ChemicalstructureoftheXChargeC18columnsurface[39]近年來,研究者們還設計了一些外表正電荷修飾的色譜柱,如Waters公司研制的外表帶電雜化色譜柱CSH系列[38],以及本課題組設計的XChargeC18色譜柱[39,40](圖2)。這類色譜柱改善堿性化合物峰形的機理在于色譜柱外表正電荷與堿性化合物溶質間的靜電排擠作用,阻止了堿性化合物向硅醇基的靠近,進而改善了峰形[19]。可以用多位點吸附理論對其進行解釋:外表正電荷的存在通過離子排擠作用,使堿性化合物不能接近在內層的高能吸附位點,而傾向于在C18鏈上的低能吸附位點吸附,進而使吸附和脫附變得均一同步,峰形也得到了改善[41]。相比于其他種類色譜柱,外表正電荷色譜柱優勢明顯:首先,它們對大多數類型堿性化合物均有較好的分離效果,即便是電荷性較強的季銨型生物堿,可以獲得較好的峰形;其次,無需使用高濃度緩沖鹽或離子對試劑,在低離子強度的揮發性緩沖鹽或者簡單的酸性條件即可獲得較好的峰形,合適質譜分析;除此之外,在高載樣量條件下,堿性化合物也能保持優異的峰形,特別合適制備。利用該類型色譜柱XChargeC18對富含季銨型生物堿的延胡索提取物進行分析,在簡單的甲酸體系下,即可獲得優異的峰形,而同條件下采用其他色譜柱分離時,峰形還是那樣較差(圖3)。盡管通過調節流動相添加劑如三乙胺或緩沖鹽,生物堿在其他類型色譜柱也能到達較好的分離效果,但是這些添加劑往往不合適質譜分析,或者對載樣量改善有限,不合適制備。圖3延胡索提取物在不同反相色譜柱上的色譜圖比擬[40]Fig.3ComparisonofchromatogramsofCorydalisyanhusuoextractondifferentreversedphasecolumns[40]a,b:XChargeC18column;c:ZorbaxEclipse5mXDBC18;d:Atlantis5mT3C18;e:XBridge3.5mC18;f:Xterra5mC18;g:inspire5mC18;h:spursilEP5mC18;i:TSKgel3mODS-100V;j:self-made5mC18/C1;mobilephase:0.1%formicacidwater(A)-CAN(B);gradientforXChargeC18:0-30min,0%-30%B;gradientforcommercialcolumns:0-30min,5%-35%B;30-40min,35%-60%B;injectionvolume:(a,c-j)50Land(b)100flowrate:1.0mL/min;columntemperature:30℃;UVdetection:254nm為了提供不同的選擇性,包括本課題組在內的研究人員,還發展了離子交換色譜[42,43]、反相/離子交換混合色譜[44]。與傳統的反相色譜相比,離子交換色譜和反相/離子交換混合作用色譜也能夠為生物堿的分離提供良好的峰形和較高的載樣量。這一類色譜柱的缺乏之處在于使用時通常需參加高濃度緩沖鹽,會增加制備后處理的工作量。3、生物堿的高效液相色譜分離分析方式方法當前,生物堿的高效液相色譜分析方式方法主要包括反相色譜、離子交換色譜、親水作用色譜以及相應的多維色譜。3.1、反相色譜法反相液相色譜是分析生物堿的最常用方式方法,該法依靠固定相和流動相間的疏水作用對中等極性和弱極性化合物進行分離。可供生物堿反相分析的固定相和流動相體系諸多,因而要注意它們間的互相配合以到達最優的分離效果。如使用常規C18色譜柱對生物堿進行分析,則需要調節流動相添加劑以改善生物堿的峰形。鄒翔等[45]采用DiamonsilC18色譜柱,添加三乙胺并用磷酸調至pH3.0,分析了白屈菜不同器官中生物堿的種類及質量占比,獲得了較好的線性關系、精致細密度和回收率。除此之外,近些年來,離子液體用作流動相添加劑來改善生物堿峰形多有報道,如朱益雷等[46]以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽為流動相添加劑,采用UltimateXB-C18色譜柱,測定了香連丸中小檗堿、藥根堿和巴馬汀3種主要季銨型生物堿含量,并獲得了比三乙胺更好的結果。當采用耐堿性的色譜柱時,流動相的pH值則能夠調節至更高層次水平。林宏英等[47]采用ZorbaxExtend-C18色譜柱,以醋酸銨為添加劑,并用氨水調至pH8.0,質譜法鑒定了13個生物堿成分,并比擬了川烏加熱前后生物堿的變化,具有較高的準確度和靈敏度。采用外表正電荷色譜柱并配合簡單的低離子強度添加劑是近年來發展起來的一種新的分析方式方法。采用本課題組自主研發的XChargeC18色譜柱,Long等[48]在0.1%甲酸的條件下,采用HPLC/CAD對貝母中異構體生物堿進行定量分析,獲得了良好的對稱因子和靈敏度。Qing等[49]利用XChargeC18色譜柱對博落回生物堿進行液質聯用分析,獲得了良好的峰形,將該方式方法應用于不同基源藥材的區分,也獲得了較好的結果。Le等[50]采用XSelectCSHC18色譜柱,在10mmol/L甲酸銨條件下,對白毛莨中的生物堿進行了LC-ESIMSn分析,獲得了良好的峰形,共鑒定出28個生物堿,華而不實包括一個新化合物和21個初次在該植物中被鑒定出來的化合物,該結果具體表現出了優異的色譜峰形對質譜鑒定的重要性。3.2、離子交換色譜法與中等極性和弱極性生物堿相比,強極性生物堿在反相形式下的保存更差,分離愈加困難,可采用陽離子交換(SCX)色譜法進行分析。劉瓊等[51]選用SpherisorbSCX色譜柱,以不同離子濃度和pH值的磷酸鹽溶液為流動相,分別對麻黃堿類、鮮益母草膠囊中的水蘇堿、使君子藥材中的胡蘆巴堿、半夏露糖漿中的麻黃堿與偽麻黃堿進行了分析。本課題組Long等[43,52]評價了鹽種類、鹽濃度、pH值和乙腈濃度對幾種強極性生物堿在SCX色譜柱上的峰寬和對稱性的影響,并對其保存機理進行了討論。圖4親水作用色譜對唐古特山莨菪餾分的分析[55]Fig.4AnalysisofalkaloidfractionsfromS.tanguticabyhydrophilicchromatography[55]mobilephase:acetonitrile(A)-100mmol/LNH4Cl(pH6.8)(B)-water(C);wavelength:210nm;flowrate:1mL/min;columntemperature:30℃;gradient:0-30min,90%-80%A,10%B,0%-10%C3.3、親水作用色譜法親水作用色譜能有效保存反相色譜中保存較差的強極性化合物,當前已被廣泛應用于強極性生物堿成分的分析中。Taujenis等[53]用HILIC-MS/MS測定了煙草中4種生物堿,獲得了較好的定量下限、回收率和準確度。卓榮杰等[54]采用AtlantisHILICSilica色譜柱分析了葫蘆巴藥材中的葫蘆巴堿,獲得了良好的分離效果和定量結果。本課題組龍珍[55]利用自制的親水柱TE-Cys對山莨菪中強極性餾分進行了分析,樣品得到了較好的保存和較好的峰形(圖4)。圖5SCX/XChargeC18二維體系分離分析山莨菪生物堿餾分[59]Fig.5AnalysisofalkaloidfractionsfromS.tanguticabySCX/XChargeC18[59]XChargeC18conditions:acetonitrile(A)-0.1%formicacid(B);gradient:0-30min,5%-15%A,95%-75%B;SCXconditions:acetonitrile(A)-100mmol/Lsodiumdihydrogenphosphate(pH2.8)(B)-water(C);wavelength:210nm;flowrate:1mL/min;columntemperature:30℃;gradient:0-20min,15%-50%A,30%-30%B,55%-20%C圖6XChargeC18色譜柱(150mm4.6mm,5m)上延胡索生物堿樣品的4個代表性制備色譜圖[38]Fig.6FourrepresentativepreparativechromatogramsofthecrudealkaloidssampleontheXChargeC18column(150mm4.6mm,5m)[38]conditions:ACN(A)-0.1%aqueousformicacid(B);gradient:0-30min,5%-15%A;30-40min,15%-60%A;flowrate:1.0mL/min;UVwavelength:320nm;columntemperature:30℃;ioadingamount:10mg;injections:5th,10th,15thand20thfromtoptodown3.4、多維色譜法由于天然產物組成復雜,單維色譜中,大量的重疊峰會給定性定量帶來不利的影響。相比于一維色譜,二維色譜能夠為復雜體系提供更好的峰容量和更高層次的分辨率,是復雜體系分離分析的重要工具[56]。在已有的生物堿分離體系中,外表正電荷色譜柱憑借分離生物堿的優異性能,常被用于二維體系的構建。Wei等[57]發展了pH值正交的全二維反相色譜法用于延胡索生物堿的分析,第一維采用了峰容量較低的耐堿性色譜柱XBridgeRPC18,以1%氨水為添加劑,第二維采用了峰容量更高層次的外表正電荷修飾的XChargeC18色譜柱,以0.15%甲酸為添加劑,該二維體系獲得了9095的峰容量。利用本課題組發展的一系列色譜柱,張敬彩[58]利用反相色譜、離子交換色譜和混合色譜不同的作用機理,針對千層塔生物堿提取物,分別構建了XChargeC18/XaquaC3、XChargeC18/XChargeSCX、XChargeC18/C18WCX3種不同形式的二維分離方式方法,并獲得了較好的正交度。本課題組Long等[59]利用反相色譜、離子交換色譜、親水色譜的不同機理,選擇構造類型不同的21種標準品,采用實驗室自制的系列色譜柱和Waters公司的XBridgeC18,構建并評價了XChargeC18/SCX、XChargeC18/XBridgeC18、XChargeC18/TE-Cys3種二維體系,并最終將XChargeC18/SCX二維體系用于山莨菪生物堿的分析和制備(圖5)。高正交二維分離體系的建立是微量、難分離的生物堿化合物高效制備的前提和基礎。4、生物堿的高效液相色譜純化制備方式方法生物堿純化制備的目的在于高效率地獲得構造新穎的新化合物,為新藥研發提供先導化合物。生物堿的分離在傳統植化領域一直是較難的對象,十分是死吸附會導致最終樣品的收率低。隨著高速逆流色譜的發展,很多學者也嘗試采用該方式方法來純化生物堿類樣品,并得到了較高的回收率[60,61,62,63]。但高速逆流色譜的分辨率較低,一次通常只能用于幾個主要成分的制備,對于生物堿樣品的系統分離,十分是含量較低的生物堿的獲得還存在較大困難。而在普通制備液相色譜中,增加上樣量后,生物堿的峰形拖尾加劇且極易降低分離度。而本課題組針對性發展的系列填料,不僅在生物堿的分析中獲得了很好的應用,還可用于天然生物堿的純化制備中,為微量、難分離的生物堿制備提供了一種解決方案。本課題組Wang等[38]采用外表正電荷XChargeC18色譜柱,以0.1%甲酸為添加劑,在分析柱上即完成了延胡索提取物中2種生物堿的純化,具有較高的載樣量、回收率和重復性(圖6);此后,他們將該體系進一步放大,最終發現了具有鎮痛作用的去氫紫堇球堿[64]。除此之外,采用強陽離子交換柱(SCX)作為第二維純化的方式方法,從延胡索提取物中獲得了-阿片受體沖動劑N-甲基四氫小檗堿[65]。本課題組Long等采用強陽離子交換柱(SCX)和外表正電荷XChargeC18色譜柱,從唐古特山莨菪中分離出了包含新化合物在內的一系列純度較高的化合物[59,66]。將該方式方法應用到唐古特山莨菪活性導向的化合物追蹤中,Du等[67]發現了6個具有M3受體拮抗活性的托品烷類生物堿,華而不實也包括新化合物,表示清楚該方式方法在發現未知活性化合物方面潛力宏大。Li等[68]采用正相-反相二維色譜對蓽拔中生物堿進行了純化制備,以正相作為第一維,采用本課題組發展的XAmide柱,反相作為第二維,采用Waters公司的AtlantisT3柱,該二維體系獲得了58.3%的正交度,分離并鑒定出28個純度較高的酰胺類生物堿,部分生物堿的質量到達克級。在上述生物堿的正交分離系統中,兩維均采用了不同的機理,正交性好,使二維系統的分離能力得到較充分地發揮,因此能夠高效率地制備出難分離的生物堿化合物。5、展望高效液相色譜技術在生物堿的分離分析和純化制備中具有廣闊的發展前景。盡管生物堿的高效分離分析方式方法已經獲得了較大進步,但其高效液相色譜制備體系仍需不斷完善。針對生物堿的高效制備問題,設計和制備一些構造不同的新型固定相,獲得優異的峰形和載樣量仍然是生物堿純化制備的一個重要發展方向,比方:正相色譜與反相色譜具有很好的正交性,可作為生物堿正交分離方式方法的補充,然而在實際對生物堿的分離中,正相色譜重現性差,峰形易前展或拖尾,保存時間隨進樣量漂移,較少用于生物堿的制備。假如能夠解決正相色譜的這些問題,將能夠為生物堿的制備體系提供很大的補充。除此之外,能夠用于強堿性生物堿的高效制備體系也比擬缺乏,當前比擬成熟的只要外表正電荷色譜柱體系,盡管陽離子交換SCX體系可以用于季銨型生物堿的制備,但該體系需使用大量的緩沖鹽。因而,需發展相應的固定相,解決季銨型生物堿的正交分離問題。綜上所述,制備型高效液相色譜的發展和推廣對加速天然生物堿的發現具有重大意義,多維正交分離的方式在復雜生物堿的分離上表現出良好的前景,相信隨著新技術和新方式方法的發展,高效液相色譜技術將在生物堿的分離制備領域具有愈加廣闊的應用空間。以下為參考文獻[1]WishartDS,KnoxC,GuoAC,ShrivastavaS,HassanaliM,StothardP,ChangZ,WoolseyJ.NucleicAcidsRes.,2006,34(S1):668-672.[2]CordellGA,Quinn-BeattieML,FarnsworthNR.Phytother.Res.,2001,15(3):183-205.[3]CushnieTP,CushnieB,LambAJ.Int.J.Antimicrob.Ag.,2020,44(5):377-386.[4]AmirkiaV,HeinrichM.Phytochem.Lett.,2020,10(16):xlviii-liii.[5]ShiXZ,LiGK,LiangZ,GuoZM,YeML,YanJY,XuGW.Chem.Bull.(石先哲,李攻科,梁振,郭志謀,葉亮堂,閆競宇,許國旺.化學通報),2020,77(7):720-730.[6]LiRP,HuangJX.Process.Chem.(李瑞萍,黃駿雄.化學進展),2004,16(2):273-283.[7]SticherO.Nat.Prod.Rep.,2008,25(3):517-554.[8]BucarF,WubeA,SchmidM.Nat.Prod.Rep.,2020,30(4):525-545.[9]McchesneyJD,RodenburgDL.Curr.Opin.Biotech.,2020,25(1):111-113.[10]ZhangH,WangSS,LiW,WangYQ,XueXY,LiangXM.WorldSci.Technol.(張慧,王世盛,李偉,王亞琴,薛興亞,梁鑫淼.世界科學技術),2018,11(2):253-256.[11]JinHL,ZhaoJQ,ZhouWJ,ShenAJ,YangF,LiuYF,GuoZM,ZhangXL,TaoYD,PengXJ,LiangXM.Rsc.Adv.,2021,5(76):62134-62141.[12]ZhaoYY,GuoZM,ZhangXL,LiangXM,ZhangYK.J.Sep.Sci.,2018,33(9):1224-1230.[13]LiXL,HuangRQ,LiuYF,JinHL,WanHH,ZhaoJQ,ZhaoWJ,LiangXM.Anal.Methods,2020,6(14):5183-5190.[14]LiW,WangSS,FengJT,XiaoYS,XueXY,ZhangH,WangYQ,LiangXM.Magn.Reson.Chem.,2018,47(10):902-908.[15]MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2018,1217(6):858-880.[16]ZhangJ,JinY,LiuYF,XiaoYS,FengJT,XueXY,ZhangXL,LiangXM.J.Sep.Sci.,2018,32(9):1401-1406.[17]StadaliusMA,BerusJS,SnyderLR.LCGCN.Am.,1988,6(6):494-500.[18]NawrockiJ.J.Chromatogr.A,1997,779(1/2):29-71.[19]HuangXJ,YangXL,LiuXL,WangJD.Chem.Reagents(黃曉佳,楊新立,劉學良,王俊德.化學試劑),2001,23(2):77-81.[20]O?sullivanGP,ScullyNM,GlennonJD.Anal.Lett.,2018,43(10/11):1609-1629.[21]MndezA,BoschE,RossM,NeueUD.J.Chromatogr.A,2003,986(1):33-44.[22]BuckenmaierSMC,MccalleyDV,EuerbyMR.Anal.Chem.,2002,74(18):4672-4681.[23]H?gglundI,St?hlbergJ.J.Chromatogr.A,1997,761(1/2):3-11.[24]NeueUD,WheatTE,MazzeoJR,MazzaCB,CavanaughJY,XiaF,DiehlDM.J.Chromatogr.A,2004,1030(1/2):123-134.[25]MccalleyDV.Anal.Chem.,2006,78(8):2532-2538.[26]GrittiF,GuiochonG.Anal.Chem.,2004,76(16):4779-4789.[27]GrittiF,GuiochonG.J.Chromatogr.A,2005,1095(1/2):27-39.[28]GrittiF,GuiochonG.Anal.Chem.,2005,77(4):1020-1030.[29]DaviesNH,EuerbyMR,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2006,1119(1):11-19.[30]LiuL,FanZC,ZhangZQ.Chin.J.Pharm.Anal.(劉嵐,范智超,張志琪.藥物分析雜志),2018(2):236-239.[31]GrittiF,GeorgesG.J.Chromatogr.A,2004,1033(1):43-55.[32]MccalleyDV.Anal.Chem.,2003,75(14):3404-3410.[33]LiuXX,PanY,WangL,LiuLJ.Chin.Phar.J.(劉學湘,潘揚,王麗,劉亮鏡.中國藥學雜志),2018,45(9):698-701.[34]WangY,TianML,BiWT,RowKH.Int.J.Mol.Sci.,2018,10(6):2591-2610.[35]ChengYF,WalterTH,LuZL,IranetaP,AldenBA,GendreauC,NeueUD,GrassiJM,CarmodyJL,O?garaJE,FiskRP.LCGCN.Am.,2000,18(11):1162-1173.[36]DaviesNH,EuerbyMR,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2008,1178(1/2):71-78.[37]WangCR,GuoZM,ZhangJ,ZengJ,ZhangXL,LiangXM.J.Sep.Sci.,2018,34(1):53-58.[38]FallasMM,BuckenmaierSMC,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2020,1235:49-59.[39]WangCR,GuoZM,LongZ,ZhangXL,LiangXM.J.Chromatogr.A,2020,1281(6):60-66.[40]GuoZM,WangCR,LiangT,LiangXM.J.Chromatogr.A,2018,1217(27):4555-4560.[41]GrittiF,GuiochonG.J.Chromatogr.A,2020,1372:42-54.[42]FlanaganRJ,HarveyEJ,SpencerEP.Forensic.Sci.Int.,2001,121(1/2):97-102.[43]LongZ,WangCR,GuoZM,ZhangXL,NordahlL,LiangXM.J.Chromatogr.A,2020,1256(18):67-71.[44]DaviesNH,EuerbyMR,MccalleyDV.J.Chromatogr.A,2007,1138(1/2):65-72.[45]ZouX,FangYN,QuZY,ShiX,LiuX,WangB,ChenM.J.HarbinUniv.Comm.:Nat.Sci.Ed.(鄒翔,方月妮,曲中原,石鑫,劉欣,汪波,陳敏.哈爾濱商業大學學報:自然科學版),2021,32(3):257-260.[46]ZhuYL,FangHH,WeiHZ,LiuSN,DuanYQ,GongM,RaoY.Chin.J.Exp.Tradit.Med.Form.(朱益雷,方海紅,魏惠珍,劉晟楠,段奕倩,龔明,饒毅.中國實驗方劑學雜志),2021,(12):75-78.[47]LinHY,SuC,DuanTX,HuangJM,SunYK,WangY,JiJJ,DongJ,LiuYG.Mod.Chin.Med.(林宏英,蘇暢,段天璇,黃建梅,孫毅坤,王玥,冀嬌嬌,董潔,劉永剛.中國當代中藥),2021,17(3):208-211.[48]LongZ,GuoZM,AcworthIN,LiuXG,JinY,LiuX,LiuL,LiangL.Talanta,2021,151(5):239-244.[49]QingZX,LiuXB,WuHM,ChengP,LiuYS,ZengJG.Anal.Methods,2021,7(5):1866-1871.[50]LePM,MccooeyeM,WindustA.Anal.Bioanal.Chem.,2020,405(13):4487-4498.[51]LiuQ,JiangSY,TianSJ.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(劉瓊,姜舜堯,田頌九.中國當代應用藥學),2004,21(1):64-67.[52]LongZ,GuoZM,XueXY,ZhangXL,NordahlL,LiangXM.Anal.Chim.Acta,2020,804:304-312.[53]TaujenisL,OlsauskaiteV,PadarauskasA.ActaChromatogr.,2021,27(2)