緩沖溶液緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內所溶解的溶質（化合物）稱之為緩沖劑，調節緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。緩沖溶液的正確配制和pH值的準確測定，在生物化學的研究工作中有著極為重要的意義，因為在生物體內進行的各種生物化學過程都是在精確的pH值下進行的，而且受到氫離子濃度的嚴格調控，能夠做到這一點是因為生物體內有完善的天然緩沖系統。生物體內細胞的生長和活動需要一定的pH值，體內pH環境的任何改變都將引起與代謝有關的酸堿電離平衡移動，從而影響生物體內細胞的活性。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內的天然環境，就必須保持體外生物化學反應過程有體內過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學的各種研究工作中和生物技術的各種開發工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質，準確恰當地選擇和配制各種緩沖溶液，精確地測定溶液的pH值，就是非常重要的基礎實驗工作。下表列出某些人體體液的pH值：1一3人體體液pH體液 PH 體液 PHiflL清 7.35 ? 大腸液 &3?8.47.45成人胃液 0.9?1.5 淚 6.6?6.9唾液 6.3?7.1 尿 4.8?7.5胰液 7.5?8.0 腦脊液 7.35 ?7.457.1基本概念（1）Bronsted-Lowry酸堿理論（又稱酸堿質子理論）。1923年由丹麥化學家J.N.Bronsted和英國化學家T.M.Lowry同時提出了酸堿質子學說，發展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質子理論或Bronsted-Lowry酸堿理1/13論。他們認為凡能釋放質子的分子或離子（如:H2O,HC1,NHf,HSOr等）稱為酸，凡能接受質子的分子或離子（如：H2O,NH3,C廠等）稱為堿。因此，一種酸釋放質子后即成為堿，稱為該酸的共轆堿，同樣一種堿與質子結合后，形成對應的酸，稱為該堿的共覘酸。A—H+B-——xA+B—HX酸1堿2堿1酸21是堿1的共覘酸，堿2是酸2的共覘堿。如鹽酸在水中的解離：HC1:~~~ +H+HC1是酸，C廠是它的共覘堿。（2）緩沖體系的設計：強電解質溶于水幾乎全部解離為正負離子，弱電解質溶于水時，則不完全解離，只有部分的分子解離出正負離子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其鹽溶于水時，只有部分HA解離為H+和A—離子，其平衡方程式如下：K,HA、一、PC+H+ （1-1）K2K°"[HA](1-2)—lg[H亠]=—lgK+lg電1(1-2)式兩邊取負對數：^A](I_3)（1-3）式中：[HA]—為弱酸的濃度[H+]—為HA解離出的氫離子濃度[A—]—為HA的共覘堿的離子濃度Kt—為酸解離的速度常數K2—為A一與H+締合的速度常數2/13Ka—為反應方程(1-1)達平衡時HA的解離平衡常數現將HA的pKa定義為一lgKa,將HA溶液的pH定義為一log［H+］,(1-3)式可寫為：(1-4)pH=pK+lg［離解形式］或:a［未離解形(1-5)方程(1-4)稱為:Henderson-Hassel-Balch方程，此方程對于生物化學學科，在理論與實踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與溶質中可解離基團p?之間的關系。很明顯，當［A—］=［HA］時：pH=pKa這就意味著當［HA］有一半解離時，溶液的pH等于pKa，此弱酸一堿緩沖體系的pKa即代表緩沖范圍的中點。一個緩沖體系的有效緩沖范圍，通常是在pKd值為中點的兩個pH單位范圍內，即：緩沖劑的有效pH范圍=pKa±l,所以，當緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的P&時，緩沖能力最大。若要設計一個新的緩沖體系時，只需按所要求的pH值查出pK“值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進行挑選即可。1960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學研究使用的緩沖體系應具有以下特性：①pK/直在6?8之間；②在水中的溶解度高；③不易穿透生物膜；④鹽效應??；⑤離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響??；⑥不與金屬離子生成復合物或沉淀；⑦該緩沖劑化學穩定；⑧紫外和可見光波長范圍內光吸收小；⑨易制得高純度的鹽。按照這些要求可以設計和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。7.2生物化學常用緩沖液(1)磷酸鹽緩沖液磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個P?值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬:NaH2PO4： pKai=2.12, pKa2=7.21Na2HPO4： pKai=7.21, pKa2=12.32配酸性緩沖液配中性緩沖液配堿性緩沖液

NaHgPCU，pH=l?4,用混合的兩種磷酸鹽，pH=6?8,用NagHPCU，pH=10?12。3/13用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因為SDS(十二烷基硫酸鈉)會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。磷酸鹽緩沖液的優點為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響?。虎芫彌_液稀釋后pH變化小,如稀釋十倍后pH的變化小于O.lo其缺點為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化作用會產生某種程度的抑XXX用。(2)Tris(三疑甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane)緩沖液Tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中己都使用Tris緩沖液,而很少再用磷酸鹽。Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：Tris-HCl緩沖液： pH=7.5?8.5Tris-磷酸鹽緩沖液：pH=5.0?9.0配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0,05mol/LTris和0.05moI/LHC1溶液，然后按表中所列體積混合。由于標準濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若IL0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11gTris堿溶于950mL?970mL無離子水中，邊攪拌邊滴加4NHC1,用pH計測定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補足到lLoTris-HCl緩沖液的優點是：①因為Tris堿的堿性較強，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發生沉淀。其缺點是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大,即：ApKa/°C=-0.031,例如：4°C時緩沖液的pH=8.4,則37°C時的pH=7.4,所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0°C?4°C。③易吸收空氣中的82,所以配制的緩沖液要蓋嚴密封。④此緩沖液對某些pH電極發生一定的干擾作用,所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。（3） 有機酸緩沖液4/13這一類緩沖液多數是用竣酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH=3.0?6.0,最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。甲酸?甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發性強，使用后可以用減壓法除之。乙酸~乙酸鈉和檸檬酸~檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個p?值：pKai=3.10,pKa2=4.75,pKa3=6.40o琥珀酸有二個P&值：pKaI=4.18,pKa2=5.60o有機酸緩沖液的缺點是：①所有這些竣酸都是天然的代謝產物，因而對生化反應過程可能發生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe%、Zn+\Mg”等）結合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結合，所以樣品中有Ca++離子時，不能用這類緩沖液。（4） 硼酸鹽緩沖液常用的有效pH范圍是：pH=8.5?10.0,因而它是堿性范圍內最常用的緩沖液，其優點是配制方便，只使用一種試劑，缺點是能與很多代謝產物形成絡合物，尤其是能與糖類的疑基反應生成穩定的復合物而使緩沖液受到干擾。（5） 氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0?11.0,例如最常用的有:甘氨酸一HC1緩沖液：pH=2.0?5.0,甘氨酸一NaOH緩沖液：pH=8.0?11.0,甘氨酸一Tris緩沖液：pH=8.0?11.0,（此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）,組氨酸緩沖液：pH=5.5?6.5,甘氨酰胺（glycineamide）緩沖液：pH=7.8?&8,甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）緩沖液：pH=8.0?9.0。此類緩沖體系的優點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環境。其缺點是：①與竣酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學反應過程，如代謝過程等。②試劑的價格較高。兩性離子緩沖液(Zwitterionicbuffers),又稱Good's緩沖液1960年，N.E.Good和他的同事們總結了現有的各種緩沖試劑的優缺點后認為，必須用人為設計和人工合成的方法來找到專門用于生命科學研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應具有前而所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Goodl緩沖液可查閱有關的資料。Good's緩沖液的主要優點是不參加和不干擾生物化學反應過程，對酶化學反應等無抑XXX用，所以它們專門用于細胞器和極易變性的、對pH敏感的蛋口質和酶的研究工作。其缺點是：①價格昂貴，②對測定蛋5/13口質含量的雙縮腺法和Lowry法不適用，因為它們會使空白管的顏色加深。常用緩沖溶液的配制方法1.甘氨酸-鹽酸緩沖液(0?05mol/L)X亳升0.2mol/L甘氨酸+Y亳升0.2mol/LHCL再加水稀釋至200亳升PHXYPHXY2.05()44.03.05011.42.45032.43.2508.22.65024.23.4506.42.85016.83.6505.0甘氨酸分子量=75.07,0.2moVL甘氨酸溶液含15.01克/升。2.鄰苯二甲酸■鹽酸緩沖液(0.05mol/L)X亳升0.2n】ol/L鄰苯二甲酸氫鉀+0.2mol/LHC1,再加水稀釋到20亳升pH(20°C)XYpH(20C)XY2.254.0703.251.4702.453.9603.450.9902.653.2953.650.5972.852.6423.850.2633.052.022鄰苯二甲酸氫鉀分子量=204.23,0.2mol/L鄰苯二甲酸氫溶液含40.85克/升3.磷酸氫二鈉■檸檬酸緩沖液PH0.2mol/L0.1mol/LPH0.2mol/L0」mol/LNa2HPO4檸椽酸(亳升)Na2HPO4檸椽酸(亳升)(亳升)(亳升)2.20.4010.605.210.729.282.41.2418.765.411.158.852.62.1817.825.611.608.402.83」716.835.S12.097.916/133.04.1115.896.012.637373.24.9415.066.213.226.783.45.7014.306.413.856」53.66.4413.566.614.555.453.87.1012.906.815.454.554.07.7112.297.016.473.534.28.2811.727.217.392.614.48.8211.187.418.171.834.693510.657.618.731.274.89.8610.147.819.150.855.010309.7()S.019.450.55Na田POA分子量=14.98,0.2mol/L溶液為28.40克/升。Na2HPO4?2H2O分子量=178.05,0.2mol/L溶液含 35.01克/升。C4H2O7?H2O分子量=210.14,0.1mol/L溶液為21.01克/升。4.檸檬酸■氫氧化鈉-鹽酸緩沖液PH鈉離子濃度檸掾酸（克）氫氧化鈉（克）鹽酸（亳升）最終體積（mol/L）CHSO7?H2ONaOH97%HC1（濃）（升）①62.20.202108416()103」0.2021083116103.30.2021083106104.30.202108345105.303524514468105.80.45285186105106.50.3S26615612610①使用時可以每升中加入1克克酚，若最后pH值有變化，再用少量50%氫氧化鈉溶液或濃鹽酸調節，冰箱保存。5.檸檬酸-檸據酸鈉緩沖液（0.1mol/L）PH0.1mol/L0」mol/L檸樣酸（亳檸掾酸鈉升）（亳升）3.01&61.43.217.22.83.416.04.03.614.95」3.814.06.04.013.16.94.21237.74.411.4&64.610.39.74.89.2KI.S

PH0」mol/L檸檬0」mol/L酸檸檬酸鈉（亳升）（亳升）5.()8.211.85.27.312.75.46.413.65.65.514.55.84.71536.03.816.26.22.817.26.42.018.06.61.418.6檸檬酸C6HO7?HO：分子量210.14,0.1mol/L溶液為21.01克/升。H 2檸檬酸鈉Na3C6H5O7?2H2O：分子量294.12,0.1mol/L溶液為29.41克/亳升。7/136.乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.2moVL）0.2mol/L03mol/L0.2mol/LpH（18°C）NaAcHAcpH（18C）NaAc0.3mol/L（亳升）（呈升）（亳升）HAc（亳升）2.60.759.254.85.904」03.81.208.805.07.003.004.01.80&205.27.902」04.22.657355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.9（）5.105.X9.400.60Na2Ac-3H2O分子量=136.09,0.2mol/L溶液為 27.22克/升。7.磷酸鹽緩沖液（1）磷酸氫二鈉■磷酸二氫鈉緩沖液（0.2）0.2mol/L0.3mol/L0.2mol/L0.3mol/LPHNa2HPO4（亳NaH2PO4（毫PHNaHPONaH2PO424升）升）（亳升）（毫升）5.88.092.07.061.039.05.910.090.07」67.033.06.012387.77.272.02&06」15.085.07377.023.06.21&581.57.481.019.06.322.577.57.584.016.06.426.573.57.687.013.06.531.56&57.789.510.56.637.562.57.891.58.56.743.556.57.993.07.06.849.551.0&094.7536.955.045.0Na2HPO4-2H2O分子量=178.05,0.2mol/L溶液為 85.61克/升。Na2HPO412H2O分子量=358.22,0.2mol/L溶液為 71.64克/升。NaH2PO4-2H2O分子量二 156.03,0.2mol/L溶液為 31.21克/升。（2）磷酸氫二鈉?磷酸二氫鉀緩沖液（1/15mol/L）PHmol/L/15NaHPO4mol/L//15KHPO4PHmol/L//15NaHPO4mol/L//15KHPO42222（亳升）（毫升）（毫升）（亳升）4.920.109.907.177.003.005.290.509.507388.002.005.911.009.007.739.001.006.242.008.00&049.500.506.473.007.008349.750.258/136.644.006.008.679.900.106.815.005.008.1810.0006.986.004.0()Na2HPO4-2H2O分子量=178.05,I/15M溶液為 11.876克/升。KH2PO4分子量=136.09,1/I5M溶液為 9.078克/升。8.磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液（0.05M）X亳升0.2MQPO#Y亳升0.2NNaOH加水稀釋至29亳升pH(20°C)X（亳升）Y（亳升）pH(20C)X（亳升）Y（亳升）5.850.3727.052.9636.050.5707.253.5006.250.8607.453.9506.451.2607.654.2806.651.7807.854.5206.852.365S.054.6809.巴比妥鈉-鹽酸緩沖液（189）PH0.04M巴比妥0.2V鹽酸PH0.04M巴比妥0.2N鹽酸（亳鈉溶液鈉溶液（亳升）升）6.810018.48.41005.217.010017.88.61003.827.210016.78.81002.527.41001539.01001.657.610013.49.21001」37.810011.479.41000.70&01009399.61000.35&21()()7.21100巴比妥鈉鹽分子M=206.18;0.04M溶液為&25克/升10.Tris-鹽酸緩沖液（0.05M,25*050毫升0.1M三疑甲基氨基甲烷（Tris）溶液與X亳升0.1N鹽酸混勻后，加水稀釋至100亳升。PHX（亳刑PHX（毫升）7.1045.7&1026.27.2044.78.2022.97.3043.483019.97.4042.0&4017.27.5040.38.5014.77.6038.58.6012.47.7036.68.701037.8034.58.80&57.9032.08.907.08.0029.29/13三疑甲基氨基甲烷（Tris）HOCH2CH20HCHOCH2NH2分子量=12