PCR檢測系統分析性能驗證

1

相關規定醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的指南CNAS-GLxx5.5.2)

實驗室應在應用于醫學檢驗之前驗證所使用的檢驗方法和程序的分析性能.對于定量檢測項目內容至少包括正確度、精密度、可報告(或線性)范圍.對于定性檢測項目內容應包括靈敏度、特異性或符合率及重復性上海市醫療機構臨床基因擴增檢驗技術審核辦法

臨床基因擴增檢驗實驗室在技術審核前應完成擬開展檢測項目方法學驗證。方法學驗證實驗應包括但不限于：精密度、正確度、檢測限、線性范圍、可報告范圍、特異性試驗2什么情況下要做性能驗證開展新項目更換檢測系統:更換儀器或試劑3

依據文件(CLSI文件)EP5-A2:定量測量方法的精密度性能評價EP6-A:定量測量方法的線性評價EP7-A:臨床化學的干擾實驗EP9-A2:用患者樣本進行方法學比對及偏倚評估EP12-A2:定性實驗方法評價用戶協議EP15-A2:用戶對精密度和準確度核實試驗EP17-A:檢出限和定量檢出限確定方案C28-A2:醫學實驗室參考區間的定義和確定5性能驗證前的準備應熟悉待驗證的檢測系統應熟悉驗證方案的步驟(PCR檢測項目成本高、陽性標本來源困難,精密度和正確度驗證可以采用EP15-A2文件)制定質量保證措施確保足夠的樣本數量和覆蓋較寬檢測范圍確定比較方法6

EP15-A2:精密度和準確度性能的用戶驗證實驗室驗證方法的操作與廠家的申明一致為驗證重復性、實驗室內精密度的申明提供方案和數據分析其他的CLSI文件為廠家做出精密度(EP5-A2)和準確度(EP9-A2)的申明提供指南7實驗要求試劑:同一批號實驗樣本以前分析過的病人樣本其他已知值的物質濃度要求:醫學決定水平廠家說明書精密度指標所用濃度內容重復性實驗室內精密度9

實驗步驟根據廠家申明的精密度比例關系可分為3種情況:1)如果σ批內<2/3σ總:每天分析1批次,2個濃度,每個濃度重復測定4次,連續5天.2)如果σ批內>2/3σ總:每天分析1批次,2個濃度,每個濃度重復測定3次,連續3天.3)如果σ批內與σ總相對關系未知:每天分析1批次,2個濃度,每個濃度重復測定4次,連續5天.每天做室內質控,如果失控,剔除數據,重新進行測定實驗數據的統計學處理:批內標準差、實驗室內標準差10結果判斷重復性驗證:批內標準差<廠家申明,驗證通過批內標準差>廠家申明,則通過計算驗證值進行差異的顯著性檢驗,批內標準差<驗證值驗證通過實驗室內精密度驗證:實驗室內標準差<廠家申明,驗證通過實驗室內標準差>廠家申明,則通過計算驗證值進行差異的顯著性檢驗,實驗室內標準差<驗證值,驗證通過

11正確度驗證比對方法:用臨床病人樣本進行方法學比對,類似EP9-A2文件參考物質13

兩種方法間病人標本結果的比較實驗設計:1)收集20份病人樣本,其濃度分布整個線性范圍,不使用超出線性范圍的標本2)在3-4天時間內,每天用實驗和比對方法測定5-7份樣本3)每天做室內質控,如果失控,剔除,問題糾正后重新測定該批標本

14

實驗數據處理

計算每個標本兩種方法間結果的差異

偏倚bi=實驗方法結果i-比較方法結果i偏倚%=100%(實驗方法結果i-比較方法結果i)/比較方法結果I畫出每個標本兩種方法結果的偏倚或百分比偏倚圖,比較兩種方法間在檢測的濃度范圍內標本結果差異是否一致計算兩種方法間的平均偏倚計算偏倚或百分比偏倚的標準差

15選擇廠家申明中使用的比較方法為本方案的比較方法如兩種方法在檢測的濃度范圍內標本結果差異不一致,應參考EP9-A2文件(用病人標本進行方法學比對和偏倚評估)來進行實驗17使用參考物質的正確度方案參考物質1)新鮮冰凍人血清或其他一些未摻入成分的人體物質:已用參考方法或決定性方法定值2)從能力比對實驗中獲得的參考物3)廠家提供的正確度確認物或質控物4)實驗室室間質評物被眾多的實驗室分析,他們的均值可用于評估一致性5)由第三方提供的已用一些不同方法定值的物質18實驗步驟至少2個物質,濃度為可報告范圍中高和低的測量范圍在3-5天內每天測定一次,每次重復2次將結果與設定要求進行比較,比如與能力比對實驗組織者的接受標準或醫學允許總誤差來比較19

概念能可靠檢出分析物的最低實際濃度,并在該濃度下的總誤差符合準確度要求總誤差目標來源:實驗室的需求、室間質評結果、廠家的申明21

實驗樣本低濃度參考物質已知濃度或活性的樣品適當稀釋成3-5個低濃度實驗樣品22

實驗步驟至少25個重復測量每個樣品重復測量的結果與該樣品的參考值比較,以確定是否超出目標誤差,超過誤差目標的結果數量可用于評價此方法在該濃度是否合適.23分析測量范圍:概念分析測量范圍(線性范圍):指患者樣本未經任何處理(稀釋、濃縮或其他預處理),由檢測系統直接測量得到的可靠結果范圍,在此范圍內一系列不同樣本分析物的測量值與其實際濃度(真值)呈線性比例關系.臨床可報告范圍:指定量檢測項目向臨床能報告的檢測范圍,患者樣本可經稀釋、濃縮或其他預處理.線性:檢測樣本時,在一定范圍內可以直接按比例關系得出分析物含量的能力.25

實驗樣品準備選擇與臨床樣本同樣的基質,不含干擾物質;或廠家推薦的產品數量驗證實驗:5-7個不同濃度的樣本,高值樣本應高于線性上限30%,低值樣本低于線性下限,

26定性檢測項目的性能驗證29兩種方法診斷明確的定性檢測性能評估:靈敏度、特異性診斷不明確的定性檢測性能評估:結果的一致性,Kappa值表示30

診斷明確的定性檢測比較方法:目前正在使用的、”金標準”方法、某種定量方法或臨床診斷樣本要求:量足夠大,穩定樣本數量:取決于評價者的目的結果不一樣標本的處理:用金標準或參考方法明確結果31檢測方法與明確診斷比較2*2列聯表靈敏度=100%[A/(A+C)]特異性=100%[B/(B+D)]陽性預測值=100%[A/(A+B)]陰性預測值=100%[A/(A+C)]檢驗效能=100%[(A+D)/N]32

診斷不明確的定性檢測項目性能評估

檢測方法、可比較方法一致程度比較一致程度百分比=