常用分子生物學試劑的選擇趙秋偉用于核酸操作的工具酶限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶如何選擇最合適的限制性內切酶限制性核酸內切酶的生物功能影響限制性核酸內切酶活性的因素限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的生物功能

主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈細菌的限制與修飾作用

hsd

R：編碼限制性核酸內切酶

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M：編碼限制性甲基化酶

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S：編碼限制性酶和甲基化酶的協同表達主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結構輔助因子識別序列切割位點異源三聚體多功能同源二聚體異源二聚體距識別序列1kb處隨機性切割旋轉對稱序列TGAN8TGCTAACN6GTGC距識別序列下游24-26bp處識別序列內或附近特異性切割GAGCC限制性核酸內切酶的類型限制性核酸內切酶單功能雙功能ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM限制性核酸內切酶的命名限制性核酸內切酶屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株HindIII同一菌株中含多個不同的限制性核酸內切酶,表示在該菌株中發現這種酶的先后次序。限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構EcoRI的切割位點EcoRI的識別序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI等產生的5’粘性末端

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’OHPOHP退火4-7℃PstI等產生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHPOHPPvuII等產生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應總體積延長反應時間措施：DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、

BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基影響限制性核酸內切酶活性的因素核酸內切酶的緩沖液性質：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發生低特異性，即所謂的Staractivity現象EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’影響限制性核酸內切酶活性的因素星號活性在非標準反應條件下,也能切割一些與其特異識別序列類似的序列。在酶的名稱右上角加一個星號(*)表示,如EcoRⅠ*。必須采用規范的實驗步驟,堅持應用推薦的反應條件。同裂酶(isoschizomer)或異源同工酶:不同來源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaudiners)：來源不同、識別序列不同，但產生相同粘性末端的酶。遠距離裂解酶(distantcleavage)：識別位點與切割位置不一致可變酶：識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的Subset酶：一種酶的識別序列包含于另一些酶的識別序列之中

酶切反應注意事項價格昂貴的酶決不能用水稀釋,以免變性失活。預先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復凍融。使用無菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會抑制酶活性。

常用內切酶的單位價格比較

產品名稱公司規格價格單位價格BamHIN50002800.056T20001200.06P25002600.104BglIIN10002800.28T5001200.24P5002280.456DpnIN5003100.62T

P2003841.9175HindIIIN50002800.056T30001200.04P50001560.03NdeIN20003100.115T4002000.5P5007411.482如何選擇最合適的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR實驗的不同需求DNA聚合酶的特性純度穩定性酶活性PCR實驗的不同需求長片段擴增PCR試劑盒

擴增效率

保真性

特異性基因組擴增、RT-PCR基因篩選、測序、基因克隆復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）構建基因圖譜、測序、分子遺傳學復雜模板擴增、大規模基因檢測特異性－熱啟動Taq酶原理

蠟封抗體抑制化學修飾特點

避免非特異性擴增提高PCR反應的特異性用途

基因組擴增

RT-PCR－熱啟動Taq酶特異性產品類型產品名稱產品性能化學修飾天為時代:HotStart

Taq

Roche:FastStart

Taq

Abgene:Thermo-start?DNAPolymerase

Stratagene:SureStart?Taq

大大提高PCR反應的特異性化學修飾不影響后續實驗抗體抑制

Invitrogen：

AccuPrimeTM

Taq

Platinum?

Taq

TaKaRa：ExTaqTM

HotStart

Version蠟封Promega：TaqBeadTM

HotStart保真性—高保真酶原理用途

表達基因的克隆基因的定點突變細胞內基因點突變分析（SNP）

3’-5’核酸外切酶活性降低堿基錯配率

保真性—高保真酶產品類型生物公司性能比較PfuDNAPolymerase

天為時代

Stratagene

Promega在目前已發現的所有耐熱聚合酶中,Pfu保真度最高堿基錯配率最低PyrobestTM

DNAPolymerase

TaKaRaTliDNAPolymerasePromega高保真＋

高擴增效率原理混合酶－高擴增效率－3’－5’核酸外切用途超長片段擴增

－測序

－構建基因圖譜復雜模板擴增－GC含量高－二級結構高保真＋高擴增效率特點產品性能高擴增效率天為時代：TaqPlus

TaKaRa：ExTaqTM

復雜模板擴增高保真天為時代：TaqPlatinum

Invitrogen：Pfx

Platinum

TaqHighFidelity

保真度低于Pfu聚合酶但擴增效率較高長片段擴增天為時代：LongTaq

TaKaRa：LATaq

Invitrogen：Elongase

AmplificaitonSystem

特別適用于保真度較高的超長片段擴增PCR

MasterMix原理預配好的PCR反應液DNA聚合酶反應緩沖液dNTPPCR增強劑

PCRMasterMixPCR

MasterMix特點

快速簡便減少加樣誤差和污染

靈敏度高

可擴增低至2個拷貝的目的模板

特異性強降低PCR反應的要求，增強特異性

穩定性好長期放置活性無改變適用范圍大規模基因檢測目的基因拷貝數極低的樣本

GC含量高,有二級結構的模板復雜基因組樣本可直接檢測菌落，基因點突變檢測,

或者陽性克隆的篩選。如何選擇最合適的DNA修飾酶酶的作用DNA連接酶修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個平頭雙鏈DNA分子還可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作輔因子。E.coliDNAligase作用于5’端帶磷酸基團的DNA底物NAD+可促進該催化反應分子克隆使用不多，亦不能連接RNA。用途:cDNA第二鏈合成。T4RNAligase催化單鏈DNA或RNA連接。主要用途是對RNA進行3＇末端標記以核酸為底物的水解酶按底物專一性分：RNase、DNase、非專一性核酸酶按作用位點分：內切或外切酶5‘-核酸酶或3’-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、綠豆核酸酶、RNaseARNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌體外切核酸酶等。許多核酸酶兼有內切和外切活性核酸酶對核酸末端羥基進行磷酸化的酶用途：放射性標記DNA鏈的5‘末端，探針標記Maxam-Gilbert化學法的