第4章細胞培養的基本

技術教學目的1、掌握細胞培養操作基本要領和要求2、了解細胞培養常用的基本方法和操作要領無菌技術貫穿細胞培養的始終一、基本操作技術和要求一、培養室內的無菌操作第一節細胞培養操作基本要領和要求(一)培養前的準備有條不紊和安全可靠1.培養用物品的滅菌消毒(寫出物品的清單)2.操作臺的消毒(各種物品布局合理進行紫外線消毒30分鐘;3.洗手和著裝(原則上與外科手術相同)4.火焰消毒(酒精燈使用、金屬器械、吸過培養液的吸管).（一）無菌操作培養前準備：準備好所需物品清點無誤放置操作場所。培養室和超凈臺消毒：0.2％新潔爾滅拖地紫外線照射30-50min/d75%alcohol擦洗臺面紫外線消毒勿照射培養細胞和培養液每天操作前洗手和著裝：嚴格按照外科手術要求消毒著裝，操作前75％alcohol消毒無菌培養操作：整個實驗過程保持無菌操作。點燃酒精燈，一切操作在火焰附近燒灼進行。燒灼時間勿過長防止退火。洗過培養液的吸管不能再燒灼。橡膠物品不能燒灼時間過長。吸管不能混用。（二）培養細胞的取材1.基本要求：

“快”，少于24h

“無菌”

用鋒利的器械切取組織減少損傷血液，脂肪，神經組織等要棄去培養液營養要豐富，胎牛血清10-20％成功率：胚胎組織>成熟個體腫瘤組織>正常組織2.基本器材和用品眼科組織剪刀彎鑷手術刀（消毒）裝有無血清培養基或Hank’s液的小瓶小燒杯培養皿3.取材皮膚粘膜取材：上皮細胞培養來源內臟和實體瘤：體內所發生腫瘤及各臟器是常用材料血細胞：靜脈，耳垂或手指取血，肝素抗凝骨髓，羊水，胸水，腹水：離心后立即培養。鼠胚組織：引頸法處死整個浸入75％alcohol5min

固定于木板取材雞胚組織：將蛋以氣室向上置燒杯中消毒剪刀環行剪開蛋殼玻璃棒挑出雞胚

（三）組織材料分離細胞懸液：500-1000rpm低轉速離心5-10min

組織塊：機械分散法:剪刀剪取后反復吹打剪切分離法：剪或切成1mm3培養

消化分離法：

⑴胰蛋白酶法

使用最廣泛。適宜消化間質少的軟組織如肝腎等，對硬癌組織效果差。所需時間較短，主要缺點是破損細胞。⑵膠原酶解離細胞法：對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質酸酶協同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。價格較高，大量使用增加成本。⑶EDTA法：較胰蛋白酶作用緩和，適宜消化分離傳代細胞。二、原代培養

取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長細胞在傳代之前稱為原代培養。

1.組織塊培養法：常用，簡單，成功率高。1000ml100ml2.消化培養法：快速得到大量活細胞，適宜培養大量組織，原代細胞產量高。步驟繁瑣，易污染，一些消化酶成本高，價格昂貴。3.器官培養：從供體獲得器官或器官組織塊后，不進行組織分離而直接在體外進行培養。要求：特殊培養條件r<1mm

足夠氧氣滲入三、傳代培養和細胞系的維持1.原代細胞的首次傳代傳代：細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶的過程。是建立細胞系關鍵的時期。細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁大部分表面以前不要傳代。根據細胞不同消化時間具體處理。首次傳代細胞數量要多。2.細胞傳代方法貼壁生長：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。懸浮生長離心法傳代直接傳代法半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3.細胞系的維持“換液”傳代”“再換液”“再傳代”“細胞凍存”4.培養細胞的純化⑴自然純化：利用某種細胞增殖優勢排擠其它細胞。無法人為選擇，時間長，適于惡性腫瘤。⑵人工純化：酶消化法：利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶耐受性不同。機械劃除法：用橡皮刮子或彎頭滴管直接從瓶壁刮除。反復貼壁法：利用上皮細胞和成纖維細胞貼壁時間和穩定性不同。培養基限定法：某些細胞在生長過程中必須存在或去處某種物質。流式細胞儀分離法：利用細胞核酸含量，某些物質含量或細胞結構大小等參數分離。5.原代培養細胞的生命歸宿原代培養期傳代期衰退期五、細胞凍存、復蘇和運輸細胞的凍存、復蘇和運輸教學目的1．掌握培養物的冷凍保存與復蘇原理2．掌握冷凍保存的常用方法3．掌握凍存細胞的常用復蘇方法4．掌握細胞運送的幾種方法□1776年Spallanzani最早發表了“冷”處理對馬精子生命活動的影響的報道，用雪冷凍玻璃瓶中的馬精子10多分鐘之后，再將玻璃瓶放回室溫下，精子又“復活”.□1900年前后，基本肯定生物成分能夠在零下溫度貯存的事實。□1949年至1960年稱“甘油時期”。□1959年：二甲亞砜（DMSO）發展史一、培養物的的冷凍保存與復蘇1．概念１）冷凍保存(cryopreservation)：是將體外培養物懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。2）復蘇(thawing)：是以一定的復溫速率將凍存的培養物恢復到常溫的過程3）因細胞內部結冰而致的細胞損傷被稱為細胞內冰晶的損傷(intracellularicedamage)。4）保存溶液溶質濃度增高而致的細胞損傷被稱為溶質損傷或稱溶液損傷(solutiondamage)原則：慢凍快融細胞的低溫冷凍儲存：

是細胞培養室的常規工作和通用技術。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。⑴原理：在低于－70℃的超低溫條件下，細胞內部的生化反應極其緩慢，甚至終止。

⑵原則：緩慢冷凍

當細胞冷到零度以下：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反．冰晶就大，大冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。細胞凍存所用用品⑶慢凍程序標準程序：當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min

當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中細胞凍存器簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。液氮罐⑷低溫保護劑的應用滲透性：具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子的物質，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等。常用的是DMSO，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

非滲透性：非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

⑸冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指能長久保存細胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細胞生化反應極其緩慢或停止，但經長期保存和復蘇后仍能保持正常的結構和功能。從實際和效益的觀點出發，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。（1）應控制凍存細胞的質量。（2）不宜將凍存的細胞放置在0～－60℃過長時間。低溫損傷主要發生在這一溫度范圍內；（3）凍存小管宜采用塑料凍存管，不宜用玻璃安瓿。注意事項⒉細胞復蘇方法原則：快速復蘇（l）操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。（2）5分鐘內用培養液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養液培養復蘇的細胞3.培養細胞的運輸冷凍儲存運輸：利用特殊容器盛液氮或干冰保存。效果好但麻煩。充液法：選生長狀態好的細胞，生長1/3－1/2瓶底壁，棄掉舊培養液，補充新培養液至瓶頸留微量空氣，封口膜封口。貼身攜帶，達目的地后倒掉多余培養液，次日換液。四、細胞系及其鑒定

原代培養的培養物中所含的細胞類型多而復雜。因此在培養初期，存活和生長的細胞類型也是多種多樣的。所以再培養不僅僅是為了維持細胞不斷地生長，而且是使培養物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養細胞，即細胞系(Cellline)。各種已被命名和經過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株，都是一些形態比較均一、生長增殖比較穩定的和生物性狀清楚的細胞群。1.細胞系鑒定當細胞系建立后，應對細胞系進行一系列鑒定后，才能應用于細胞生物學、免疫學、細胞遺傳學等方面的研究。細胞系的細胞來源鑒定細胞系的純度，即除了主類細胞外，還雜有哪類細胞細胞系的穩定性，即在細胞連續培養過程中主要指標應無明顯變化累積細胞系的形態及其表達特征的基本數據，以及其與來源細胞的差異等2.細胞系鑒定指標⑴染色體：染色體是一種鑒定細胞系的種屬、性別來源較為確切的指標；也是檢查細胞系是否趨于穩定，在離體培養條件下細胞有否發生轉化的可靠指標；是區別正常細胞與惡性細胞的指標。采用染色體數目、核型分析以及染色體分帶技術檢測。⑵同工酶譜：通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據條件選擇。

⑶細胞DNA遺傳特征:

3.細胞株建立要求及管理⑴記錄要求：

組織來源、細胞生物學檢測、培養條件和方法⑵鑒定、管理和使用

按國際慣例，在雜志或刊物上報道，詳細介紹上述各項目即可。各國管理中心、細胞庫美國標準細胞庫ATCC(AmericanTypeCultureCollection)、人遺傳突變細胞庫HGMR、細胞衰老細胞庫CAR

ATCC入庫細胞要求檢測項目（基本要求）：

培養簡歷：組織來源日期、物種、供