實驗六微生物學教研室郭棵棵噬菌體噬斑觀察（驗證性實驗）操作：1、腸道菌的分離與鑒定（三）（接種半固體、蛋白胨水、尿素、斜面）2、噬菌體培養(yǎng)（平板法）材料：1、半固體、蛋白胨水、尿素、斜面各1支/人2、普通平板1塊/3人

3、菌種及噬菌體標本各1支/6人

實驗內(nèi)容錄像：厭氧菌的分離與鑒定上次課結果觀察了解：厭氧菌的分離鑒定方法

噬菌體的生物學特點掌握：噬菌體培養(yǎng)的方法和意義[教學目標]

重點：噬菌體培養(yǎng)的操作方法

難點：噬菌體培養(yǎng)的操作方法[重點難點]上次結果觀察克氏雙糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)結果觀察：部分培養(yǎng)基高層變黃，斜面維持原有紅色；部分培養(yǎng)基高層、斜面均變?yōu)辄S色；有的培養(yǎng)基不光有顏色變化，還出現(xiàn)氣泡或裂隙；有的培養(yǎng)基出現(xiàn)黑色物質(zhì)。Why？葡萄糖、乳糖：

可被細菌分解產(chǎn)酸產(chǎn)氣，通常將培養(yǎng)基的高層的顏色改變代表葡萄糖，斜面代表乳糖。

蛋白胨：細菌分解可產(chǎn)生H2S

硫酸亞鐵：與H2S結合形成FeS黑色沉淀

酚紅指示劑:

pH范圍6.8-8.4(酸黃堿紅)克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（復習）克氏雙糖培養(yǎng)基培養(yǎng)結果判斷分解葡萄糖乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：

——

高層、斜面均變黃

——

培養(yǎng)基出現(xiàn)氣泡、裂隙未產(chǎn)生H2S：無黑色FeS出現(xiàn)分解葡萄糖：高層變黃不分解乳糖：斜面仍為紅色不產(chǎn)氣：無氣泡、裂隙出現(xiàn)未產(chǎn)生H2S：無黑色FeS出現(xiàn)大腸桿菌痢疾桿菌分解葡萄糖：高層變黃不分解乳糖：斜面紅色產(chǎn)氣：培養(yǎng)基出現(xiàn)氣泡、裂隙產(chǎn)生H2S：出現(xiàn)黑色FeS甲型副傷寒桿菌乙型副傷寒桿菌分解葡萄糖：高層變黃不分解乳糖：斜面紅色產(chǎn)氣：培養(yǎng)基出現(xiàn)氣泡、裂隙未產(chǎn)生H2S：無黑色FeS出現(xiàn)分解葡萄糖：高層變黃不分解乳糖：斜面紅色產(chǎn)生H2S：出現(xiàn)黑色FeS不產(chǎn)氣：培養(yǎng)基無氣泡、裂隙出現(xiàn)傷寒桿菌標本膿血便、肛拭子選擇/鑒別培基生化反應血清學鑒定半固體,蛋白胨水,尿素培養(yǎng)基，斜面S.S平板，KIA玻片凝集試驗腸道菌分離鑒定步驟（續(xù)）操作取克氏雙糖鐵培養(yǎng)基斜面上的菌苔，分別接種半固體培養(yǎng)基觀察細菌有無動力。蛋白胨水培養(yǎng)基用于觀察細菌能否分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)。尿素培養(yǎng)基是根據(jù)酚紅指示劑變色來判斷細菌是否分解尿素產(chǎn)堿。斜面培養(yǎng)基是為下一次血清學鑒定提供菌種。腸道菌分離與鑒定（三）（接種半固體、蛋白胨水、尿素、斜面）操作一

半固體培養(yǎng)——

動力試驗（氯化三苯四氮唑）加入指示劑TTC腸科桿菌動力試驗結果：大腸埃希菌陽性？陰性？痢疾志賀菌陽性？陰性?傷寒沙門菌陽性？陰性？用于檢查細菌是否具有鞭毛，能否運動？蛋白胨水培養(yǎng)——

吲哚（indol）試驗

色氨酸吲哚對位二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚紅色靛基質(zhì)指示劑腸科桿菌吲哚試驗結果：大腸埃希菌陽性？陰性？變形桿菌陽性？陰性？痢疾志賀菌陽性？陰性?傷寒、副傷寒陽性？陰性？檢測細菌是否分解色氨酸產(chǎn)生吲哚（靛基質(zhì)）？+—變形桿菌→尿素→氨紅色+酚紅尿素酶試驗尿素酶試驗結果檢測細菌是否產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)氨？（酚紅顏色改變：酸黃堿紅）腸科桿菌尿素酶試驗結果：大腸埃希菌陽性？陰性？變形桿菌陽性？陰性？痢疾志賀菌陽性？陰性?傷寒、副傷寒陽性？陰性？操作二噬菌體培養(yǎng)噬菌體（Bacteriophage）是一類能感染細菌、放線菌、螺旋體、支原體和真菌等微生物的病毒。（1）個體微小，能通過除菌濾器；（2）結構簡單：核酸+蛋白；（3）種類繁多，分布廣泛；（4）專性細胞內(nèi)寄生；（5）嚴格宿主特異性。生物學特點：蛋白質(zhì)外殼核酸：DNAorRNA尾領尾髓尾鞘尾板：含溶菌酶尾刺尾絲：粘附功能頭部尾部在電鏡下，呈蝌蚪形，微球形及細桿形三種形態(tài)。噬菌體的形態(tài)與結構蝌蚪形噬菌體毒性噬菌體（virulentphage）：感染宿主菌后，能在宿主菌細胞內(nèi)獨立復制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解宿主菌的噬菌體。（1）毒性噬菌體與溶菌反應固體培養(yǎng)基：形成稱為噬斑（Plaque）溶菌反應的結果：液體培養(yǎng)基：菌液由混濁變清亮。噬菌體的分類噬斑（plaque）：噬菌體和宿主菌在固體培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)后形成的透明或半透明區(qū)域。一個噬斑是由一個噬菌體復制增殖并裂解宿主菌后形成的。（2）溫和性噬菌體與溶源性反應溫和噬菌體（temperatephage）：噬菌體基因組與宿主菌染色體基因組整合，隨細菌基因組的復制而復制，并隨細菌分裂而傳代，細菌不裂解，也不產(chǎn)生子代噬菌體，也稱之為溶原性噬菌體。前噬菌體（Prophage）：整合在細菌染色體上的噬菌體基因組。

溶原性細菌（lysogenicbacterium）：帶前噬菌體基因組的細菌。（1）平板一分為二，分別標記為1、2區(qū)。（2）接種環(huán)蘸取菌液分別在1區(qū)和2區(qū)均勻密集劃線，1區(qū)接種DH5a，2區(qū)接種對照菌。（3）用接種環(huán)蘸取DH5a的噬菌體貼加于