現代生物技術涉及?現代生物技術的發展趨勢?新型生物反映器?生物技術藥物分類生物技術藥物的特點生物技術在制藥中的應用基因的概念與特性DNA的復制與表達基因工程制藥醫用活性蛋白和多肽類基因工程技術生產藥品的優點基因工程藥物生產的過程目的基因的獲得、克隆真核基因常用方法人工化學合成基因的限制基因篩選的新方法、對已發現基因的改造最佳的基因表達體系適合目的基因表達的宿主細胞應滿足哪些規定大腸桿菌中的基因表達原核細胞的基因組特點基因克隆載體的定義、特點質粒的分類真核基因在原核細胞中表達載體必須具有條件影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素基因工程菌生長代謝的特點（菌體的生長與能量、前體供應的關系）基因工程菌的不穩定性（質粒、分裂、結構不穩定)、其重要機制常見分裂不穩定的兩個因素、提高質粒穩定性的方法基因工程菌的培養方式影響發酵的因素有高密度發酵特點、影響因素實現高密度發酵的方法基因工程藥物的分離純化分離純化的方法、基本原理分離純化工藝應遵循的原則基因工程藥物的質量控制、保存動物細胞的形態、生理特點動物細胞來源的藥物的種類動物細胞的培養條件、培養基動物細胞大規模培養的方法、特點、培養方式動物細胞生物反映器的類型、抱負反映器的基本規定動物細胞產品純化方法、動物細胞制藥的前景單克隆抗體及其制備基因工程抗體及其制備噬菌體抗體庫技術的基本方法、特點基因工程抗體表達抗體診斷試劑的類型抗體治療藥物的種類植物組織和器官的培養次級代謝產物特點、作用植物細胞培養的培養基的組成、固定化反映器影響植物次級代謝產物生產和累積的因素植物細胞大規模培養生物反映器的類型、性能比較植物細胞固定化培養優缺陷植物細胞大規模培養程序植物生物反映器選擇標準植物細胞制藥的進展與展望酶的特點、來源酶工程的研究內容運用微生物生產酶制劑的優點固定化酶的特點酶和細胞固定化方法與制備技術固定化細胞的特點固定化細胞反映器的類型和特點模擬酶的的概念及分類酶的化學修飾的目的和意義酶化學修飾的方法修飾酶的特性酶化學修飾的應用及其局限性酶的化學修飾的前景有機相酶反映的優點、有機溶劑、影響酶工程優點發酵工程的研究內容優良菌種的選育誘變育種的方法和原理營養缺陷型的作用發酵類型、特點發酵工藝控制細胞破碎的方法及其優缺陷抱負的微生物細胞生物反映器基本規定基因工程在發酵工程中的應用基因工程菌的遺傳不穩定性的兩種重要表現形式是什么?重要機制是什么?在人胰島素AB鏈分別表達法中,為什么將AB鏈編碼序列與ｂ-半乳糖苷酶基因融合？闡述基因工程藥物研制有那些重要過程?對鼠源性單克隆抗體進行改造的目的是什么?鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類型？抗體治療藥物有哪些?１.現代生物技術涉及:⑴重組DＮA技術⑵細胞和原生質體融合技術⑶酶和細胞的固定化技術⑷植物脫毒和快速繁殖技術⑸動物和植物細胞的大量培養技術⑹動物胚胎工程技術⑺現代微生物發酵技術⑻現代生物反映工程和分離工程技術⑼蛋白質工程技術⑽海洋生物技術２.現代生物技術的發展趨勢重要體現在下列幾個方面:①基因操作技術日新月異,不斷完善。②新技術、新方法一經產生便迅速地通過商業渠道出售專項技術,并在市場上加以應用。③基因工程藥物和疫苗的研究和開發突發猛進。④新的生物治療制劑的產業化前景十分光明，2１世紀整個醫藥工業將面臨全面的更新改造。⑤轉基因植物和動物取得重大突破⑥現代生物技術在農業上的廣泛應用將給農業和畜牧業生產帶來新的奔騰。⑦闡明生物體基因組及其編碼蛋白質的結構與功能是當今生命科學發展的一個主流方向，⑧基因治療取得重大進展,有也許革新整個疾病的防止和治療領域。⑨蛋白質工程是基因工程的發展，它將分子生物學、結構生物學、計算機技術結合起來，形成一門高度綜合的學科。⑩信息技術的奔騰發展滲透到生命科學領域中,形成形成引人注目、用途廣泛的生物信息學。3新型生物反映器有:1．氣升式生物反映器2.流化床式生物反映器3.固定床式生物反映器４．袋式或膜式生物反映器5.中空纖維生物反映器4.生物技術藥物分類1.重組DNA技術制造的多肽、蛋白類藥物2.基因藥物，涉及基因治療藥、基因疫苗、反義藥物、核酶３.來自動、植物、微生物的天然藥物4.合成與半合成的生物藥物按照醫學用途分類：１.治療藥物，治療疾病是生物藥物的重要功能。2.診斷藥物，具有速度快、靈敏度高、特異性強的特點。3．防止藥物，對于許多傳染性疾病來說,防止比治療更重要。5.生物技術藥物的特性1．分子結構復雜2.具有種屬特異性3．治療針對性強，療效高４.穩定性差5.基因穩定性6．免疫原性7.體內t1/2短８．受體效應9.多效性和網絡性效應10.檢查的特殊性６．生物技術在制藥中的應用(1)基因工程藥物品種的開發；(2）基因工程疫苗；（３)基因工程抗體；（4)基因診斷與基因治療;(5)應用基因工程技術建立新藥的篩選模型；(6)應用基因工程技術改良菌種，產生新的微生物藥物;（7)基因工程技術在改善藥物生產工藝中的應用;(8）運用轉基因動、植物生產蛋白質類藥物。7.基因的概念與特性概念:DNＡ分子中具有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質的最小功能單位。特性:①基因可自我復制,②基因決定蛋白質結構,③基因可突變。基因按功能分為:①結構基因②調控基因DNＡ的結構與性能⒈DNA的結構：四種核苷酸(ATCG）連接一級結構、ＤNＡ二級結構（α，β）,雙螺旋結構。⒉DNA的性質與功能:①吸取光譜２6０②電場中泳動③變性、復性、雜交８．DＮA的復制與表達基因表達⒈轉錄:在ＲＮA聚合酶的催化下以ＤNA為模板合成mRNA的過程。2.翻譯:以mRNA為模板,tRNＡ作為運載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質的過程。（１)分為三個階段：①起始②延長③終止（2)翻譯后的肽鏈加工:①羥基化②糖基化③磷酸化④乙酰化9.基因工程制藥醫用活性蛋白和多肽類涉及：①免役性蛋白,如各種抗原和單克隆抗體。②細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、集落刺激生長因子、表皮生長因子及凝血因子。③激素,如胰島素、生長激素、心鈉素。④酶類,如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑及超氧化物岐化酶等。１０.基因工程技術生產藥品的優點1.運用基因工程技術可大量生產過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細胞因子等)，為臨床使用建立有效的保障。2.可以提供足夠數量的生理活性物質,以便對其生理、生化和結構進行進一步的研究,從而擴大這些物質的應用范圍。３．運用基因工程可以發現挖掘更多的內源性生理活性物質。4．內源生理活性物質在作為藥物使用時，存在局限性之處，可以通過基因工程和蛋白質工程進行改造。5．運用基因工程技術可獲得新型化合物,擴大藥物篩選來源。11.基因工程藥物生產的過程（環節)⒈目的基因的克隆⒉構建DAN重組體⒊DＡN重組體轉入宿主菌⒋構建工程菌⒌工程菌發酵⒍表達產物的分離純化⒎產品的檢查等基因工程藥物制藥的重要程序獲得目的基因→組建重組質粒→構建工程菌(或細胞）→培養工程菌→產物分離純化→除菌過濾→半成品檢定→成品檢定→包裝12.目的基因的獲得克隆真核基因常用方法:逆轉錄法和化學合成法。①逆轉錄法:逆轉錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉錄成cDNA，然后進行ｃDNＡ的克隆表達。⒈mＲNA的純化⒉ｃDNA第一鏈的合成⒊cDＮＡ第二鏈的合成⒋cDNA的克隆⒌將重組體導入宿主細胞：⒍cＤNA文庫的鑒定：抗性基因失活法、噬菌斑顏色改變法⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定：核酸探針雜交法、免疫反映鑒定法②化學合成法：較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質的氨基酸順序。再按相應的密碼子推導出DＮＡ的核甘酸序列。用化學法合成目的基因ＤＮA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的ＤＮA雙鏈片段,然后將這些雙鏈片段按對的的順序進行退火使連接成較長的ＤNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。１３.人工化學合成基因的限制有:⒈不能合成太長的基因目前DNＡ合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為5０～60bp,因此只合用于克隆小分子肽的基因。⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難,用氨基酸順序推測核苷酸序列,得到的結果也許與天然基因不完全一致,易導致中性突變。⒊費用高。14．基因篩選的新方法1.編碼序列富集法2.島嶼獲救PCR法3.動物雜交法4．功能克隆法5.構建cDNA文庫６.差異顯示技術的應用對已發現基因的改造應用基因修飾技術和點突變技術提高目的基因表達產物的穩定性、t1／2、提高表達量，減少毒性或免疫原性。１5.最佳的基因表達體系：;目的基因的表達產量高;表達產物穩定;生物活性高和表達產物容易分離純化16.宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應滿足以下規定:1．容易獲得較高濃度的細胞；2.能運用易得便宜原料；３.不致病、不產生內毒素；4.發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；5容易進行代謝調控;6.容易進行ＤNA重組技術操作；7．產物的產量、產率高，產物容易提取純化。17．大腸桿菌中的基因表達載體:是基因工程的目的和基本手段,是選用合適的載體把供體ＤNＡ(外源基因）運載到受體細胞內,從而復制擴增大量的目的DNA分子或轉錄表達為相應的產物?；蚬こ梯d體分為:克隆載體,轉錄載體，表達載體;ＤNA(克隆載體)→DNＡ(轉錄載體）→RＮA→蛋白質→（表達載體)１8．原核細胞的基因組特點:①染色質為環狀雙股DNA分子②具有操縱子結構③結構基因多為單拷貝④特定區域分布特異ＤNA順序，因此外源DNＡ分子可以插入原核細胞DＮＡ復制體系的特定區段1９．基因克隆載體定義：基因克隆載體是一類可以承載外源基因并將其帶入受體細胞得以穩定維持的DＮＡ分子。2)目前經常使用的載體,有質粒和病毒兩類。各種不同的載體,盡管分子量大小、結構和用途上存在著較大的差異,但是作為載體,它們應當具有一些共同的特性。特點:①具有復制子②有單一限制內切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標記如抗藥基因④拷貝數高⑤生物安全性好20．質粒的分類⒈按復制型式①嚴緊型②松弛型⒉按基因轉移性①傳遞性質粒②非傳遞性質粒⒊按遺傳性狀產物分類:①抗生素抗性②限制酶、修飾酶系統21．真核基因在原核細胞中表達載體必須具有條件⑴載體可以獨立復制。載體自身是一個復制子，具有復制起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNＡ聚合酶所辨認。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制,只有當誘導時才干進行轉錄。⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產生的mRNＡ較為穩定。⑹所產生的ｍRＮA必須具有翻譯的起始信號ＡUG和SD序列，以便轉錄后順利翻譯。２2.影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數：外源基因是克隆到載體上的,因此載體在宿主菌種的拷貝數就直接關系到外源基因的拷貝數。⑵外源基因的表達效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼AＴG的間距④密碼子組成⑶表達產物的穩定性:①組建融合基因，產生融合蛋白；②運用大腸桿菌的信號肽或某些真核多肽中自身的信號肽，把真核基因產物搬動到胞漿周質的空隙中;③采用位點特異性突變的方法，改變真核蛋白質中二硫鍵的位置,從而增長蛋白質的穩定性;④采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌，有也許減弱表達產物的降解。⑷細胞代謝負荷：⑸工程菌的培養條件:外源基因的高水平表達,不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的互相關系，并且與其所處的環境條件息息相關,必須優化基因工程菌的培養條件，進一步提高基因表達水平。2３．基因工程菌生長代謝的特點①菌體的生長與能量的關系碳源物質是組成培養基的重要成分。碳源物質為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產生乙酸,導致培養基的pH值下降,從而影響菌體的生長。提高ｐＨ，可減少乙酸的克制作用。分批培養中選擇不同的碳源,連續培養中控制稀釋速率等都能一定范圍內控制菌體的生長，從而控制乙酸的產生，減少它的克制作用。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產生。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作為宿主細胞，阻止乙酸產生,可提高產量。②菌體生長與前體供應的關系在基礎培養基中加入氨基酸(小分子前體)能使菌體比生長率提高,蛋白合成增長?；蚬こ叹|粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結構，致工程菌生長速率減少。質粒存在對菌體代謝的影響：中檔拷貝質粒（56拷貝)的工程菌中與前體合成有關的酶增長，這些酶的基因大多受終產物的反饋調節。如：三羧酸循環關鍵酶、天冬氨酸轉?；傅取８呖截愘|粒的工程菌(24０拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被運用引起前體局限性，從而產生“嚴緊反映”有關。“嚴緊反映”是當氨酰tＲNＡ局限性時,核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點的pｐGpp的結果。24.基因工程菌的不穩定性、重要機制質粒不穩定：基因工程菌在傳代（25代以上)過程中常出現的現象。分裂不穩定:指工程菌分裂時出現一定比例不含質粒子代菌的現象。結構不穩定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變產生機制：１.受體細胞中的限制修飾系統對外源重組DNA分子的降解。2.外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝。3．重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分派,這是重組質粒逃逸的基本因素。4.受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排。2５.常見分裂不穩定的兩個因素:⑴含質粒菌產生不含質粒子代菌的頻率（質粒丟失率);⑵這兩種菌(含質粒菌和不含質粒菌)比生長速率差異的大小。提高質粒穩定性的方法1.合適的宿主:宿主菌2.合適的載體:質?？截悢?．選擇壓力：抗生素４．分階段控制培養:⑴先使菌體生長至一定密度;⑵再誘導外源基因的表達5.控制培養條件：溫度、pＨ值、培養基組分、溶氧6．固定化:卡拉膠26.基因工程菌的培養方式：1分批培養;2補料分批培養;3連續培養;4透析培養；5固定化培養27．影響發酵的因素有：⒈培養基⒉接種量⒊溫度⒋溶解氧⒌誘導時機⒍誘導表達程序7.pH2８.高密度發酵特點：菌體高密度,總表達量高；生物反映器體積小；單位體積生產能力高;生產周期短，分離成本小影響因素1.培養基:C源、N源種類和含量；C:Ｎ含量比值；微量元素；無機鹽(磷影響表達質粒的復制速率)２.溶氧濃度:空氣分離系統提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中，提高氧傳質能力;菌體與小球藻混合培養，藻細胞光合作用產氧供菌體呼吸。3.ｐＨ值:大腸桿菌產酸、ＣＯ２必須加堿調節pH值4．溫度:控制菌體生長，溫控誘導表達(誘導時機和連續時間,對數生長期，2miｎ）5.代謝副產物：C源物質供應超過三羧酸循環或電子傳遞鏈能力,產生乙酸，克制菌體生長和蛋白表達。采用流加補料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸克制乙酸生成。29.實現高密度發酵的方法１．發酵條件的改善（1)培養基的選擇:（2)建立流加式培養方式;(３）提高供氧能力2.構建產乙酸能力低的工程化宿主菌(1)阻斷乙酸生產的重要途徑：（２)對碳代謝流進行分流：（3）限制進入糖酵解途徑的碳代謝流；（4)引入血紅蛋白基因。3.構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌３０.基因工程藥物的分離純化一.細胞破碎１.物理破碎法(1）高壓勻漿法(2）高速珠磨法（３)超聲破碎法(４）高壓擠壓法2.化學破碎法(１)滲透沖擊(2)增溶法(3）脂溶法３.生物破碎法:酶溶法二.固液分離１.離心沉淀法2.膜過濾法3.雙水相萃取三、重組蛋白的分離純化技術①技術條件溫和能保持產物生物活性。②選擇性好,能從復雜的混合物中有效的將目的產物分離，達成較高的純化倍數。③收率要高。④兩個技術間能直接銜接，不需要對物料加以解決。⑤純化過程要快,滿足高生產率的規定。目的產物的分離純化蛋白質分離純化方法的設計根據其分子的理化性質和生物學特性來決定。31.分離純化的方法:色譜分離方法⑴離子互換層析(IEC）離子互換層析的基本原理是通過帶電的溶質分子與離子互換劑中可互換的離子進行互換,從而達成分離的目的。它具有分辨率高容量大操作容易,該法已成為多肽蛋白質核酸分離純化的重要方法。⑵反相色譜和疏水色譜反相色譜和疏水色譜是根據蛋白質疏水性的差異來分離純化的。反相色譜是運用溶質分子中非極性基團與非極性固定相之間互相作用力的大小以及溶質分子中極性基團與流動相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進行分離的。疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，重要是運用蛋白質分子表面上的疏水區域和介質中的疏水基團之間的互相作用，無機鹽的存在能使互相作用力增強。固定相介質表面的疏水性比反相色譜介質表面的疏水性弱。為有機聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。⑶親和層析（AC)是運用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附。配基:在親和層析中起可逆性結合的特異性物質。載體：與配基結合的支撐物。親和層析可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸⑷凝膠過濾層析凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質,小分子能進入孔內，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內，快速移動,運用這種移動差別可使大分子與小分子分開。根據蛋白質的相對分子量和蛋白質分子的動力學體積的大小差異,可以運用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。重要應用兩個方面：①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質分子的分級分離。在產品的形成階段前用于除去產物的多聚體及降解產物。３2.分離純化工藝應遵循以下原則:⑴具有良好的穩定性和反復性⑵盡也許減少組成工藝的環節⑶各技術環節間要互相適應和協調⑷工藝過程中盡也許少用試劑⑸工藝所用時間要短⑹工藝和技術必須收率高、易操作、能耗低⑺具有較高的安全性33．基因工程藥物的質量控制產品的鑒定、純度、活性、安全性、穩定性和一致性。產品的保存⒈液態保存⑴低溫保存⑵在穩定pH條件下保存⑶高濃度保存⑷加保護劑保存⒉固態保存:冷凍干燥(預凍、升華、解吸干燥去除吸附水）３４.動物細胞的形態和生理特點離體培養細胞類型⒈貼壁細胞生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養基中提供的粘附因子才干在該表面上生長。兩種形態：成纖維細胞型(來源于中胚層組織的細胞）;上皮細胞型（來源于內、外胚層組織的細胞）⒉懸浮細胞生長不依賴支持物表面,在培養液中呈懸浮狀態生長。如淋巴細胞。⒊兼性貼壁細胞生長不嚴格依賴支持物。動物細胞的生理特點（⒈）動物細胞的分裂周期長:（⒉）細胞生長需貼附于基質,并有接觸克制現象。（⒊）正常二倍體細胞的生長壽命是有限的。（4)動物細胞對周邊環境十分敏感:對理化因素敏感,(⒌）動物細胞對培養基規定高：必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因子、貼壁因子等。（⒍)動物細胞蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同。３5.動物細胞來源的藥物的種類(⒈）動物細胞多肽與蛋白質類藥物(⒉)動物酶與輔酶類藥物（⒊)動物核酸類藥物(⒋)動物糖類藥物：（⒌)動物脂類藥物動物細胞生產的藥物特點優點:分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾蛋白糖基化，與天然產品一致。缺陷:培養條件高、成本貴、產量低，安全性問題。３6.動物細胞的培養條件和培養基細胞體外培養基本條件:①無菌②營養充足,防止有害物質③氧氣④隨時清除代謝有害物質⑤良好的生存外環境:pH、滲透壓、離子濃度⑥及時分種,適當的細胞密度動物細胞的培養基的種類和組成⒈天然培養基:血清、羊水、腹水等。成分復雜、成分不穩定,來源少。2.合成培養基（常用培養基成分及配方）⑴氨基酸⑵維生素⑶糖類⑷無機鹽⑸其它成分添加小牛血清的作用⑴提供生長因子和激素⑵提供貼附因子和伸展因子⑶提供結合蛋白（辨認離子、激素、維生素、脂質）⑷提供必需脂肪酸和微量元素3.無血清培養基優點：①提高反復性(細胞)②減少微生物污染(病毒）③供應充足穩定④細胞產品易純化⑤避免血清因素對細胞的毒性⑥減少血清中蛋白對生物測定的干擾動物細胞培養的基本方法細胞分離、細胞計數、細胞傳代、細胞的凍存和復蘇3７.動物細胞大規模培養的方法１.懸浮培養：懸浮培養即讓細胞自由地懸浮于培養基內生長增殖。它合用于一切種類的非貼壁依賴性細胞（懸浮細胞），也合用于兼性貼壁細胞。優點是操作簡便，培養條件均一,傳質和傳氧較好,容易擴大培養規模。缺陷是由于細胞體積較小,較難采用灌流培養，因此細胞密度一般較低２.貼壁培養：貼壁培養是必須讓細胞貼附在某種基質上生長繁殖的培養方法。它合用于一切貼附依賴性細胞(貼壁細胞），也合用于兼性貼壁細胞。優點是合用的細胞種類廣,較容易采用灌流培養的方式使細胞達成高密度;缺陷是操作比較麻煩,需要合適的貼附材料和足夠的面積,培養條件不均一，傳質和傳氧較差。３．貼壁－懸浮培養(假懸浮培養）:微載體培養既可發明相稱大的貼附面積供細胞貼附生長增殖,滿足了絕大多數細胞的基本規定,載體體積小，比重較輕,在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由地懸浮在培養基內,充足發揮了懸浮培養的一切優點。操作方式1.分批式操作2.半連續式操作3.灌流式操作:取出、補充培養基,細胞仍保存在反映器內。優點:1．營養好,代謝廢物少。2.細胞密度高(107～1０８個/mL)產量高。3.產品罐內停留時間短。4.培養基比消耗率低。３8.動物細胞生物反映器的類型⒈攪拌罐式生物反映器⒉氣升式生物反映器⒊中空纖維式生物反映器⒋透析袋或膜式生物反映器⒌固定床或流化床式生物反映器基本規定1.生物反映器的材料無毒2.生物反映器的結構:滿足傳質、傳熱、混合的功能３．密封良好,避免污染4.自動檢測、調節控制精度高5．長期連續運轉6.容器內表面光滑,無死角７.拆裝、連接、清潔方便,能耐高壓蒸汽消毒8．設備成本低３９．動物細胞產品純化方法1.離心2.離子互換層析３.凝膠過濾4.親和層析5.鹽析和有機溶劑沉淀６．透析7.高壓液相層析動物細胞制藥的前景(一)、改善表達載體，提高表達水平和產量(二)、運用代謝工程，改善培養工藝，減少生產成本(三）、克制細胞凋亡，延長培養周期(四)、采用糖基化工程，提高產品質量(五)轉基因動物的研究（六）、組織工程的研究單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩定、可大量生產等特點,４0.單克隆抗體及其制備制備單克隆抗體(McAｂ）是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合,通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的?？乖c動物免疫制備特定抗原的單克隆抗體,一方面要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。有的抗原可以用化學合成：地高辛。多數抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。為使雜交瘤細胞穩定，采用免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB／c小鼠和ＬOU大鼠,因此免疫動物也采用相應的品系。４1.基因工程抗體及其制備雜交瘤單抗為鼠源性,應用人體產生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性的單抗進行基因加工和改造。目的：減少免疫源性；減少相對分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體。基因工程抗體的類型:人鼠嵌合抗體、改形抗體、Fab與Ｆv抗體、單鏈抗體、單域抗體和分子辨認單位（最小辨認單位)4２．抗體工程噬菌體抗體庫技術的基本方法①獲取目的基因②抗體庫技術的載體（噬菌體ｐhagｅmiｄ）③淘篩④表達與鑒定特點（⒈)模擬天然全套抗體庫（⒉)避開了人工免疫和雜交瘤技術(⒊）可獲得高親和力的人源化抗體43.基因工程抗體表達(⒈)原核細胞表達(融合表達,分泌表達）（⒉）真核細胞表達(分泌表達)（⒊)轉基因植物表達(⒋）轉基因動物表達4４.抗體診斷試劑的類型:一、血清學鑒定用的抗體類試劑二、免疫標記技術用的抗體類試劑三、導向診斷藥物四、CD單克隆抗體系列45.抗體治療藥物的種類：以抗體為載體的導向治療藥物一、放射性同位素標記的抗體治療藥物:抗體作為放射性核素的導向載體，標記操作簡便,用量小。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯的抗體藥物：⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤（MTX)、阿霉素（ADM）、絲裂霉素(MＭC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體,可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTＸ量，使體外細胞毒性提高二倍。⒉抗體類藥物逆轉耐藥性。3．抗體導向酶－前藥療法（antｉｂｏｄｙｄｉreｃｔeｄenｚymeprｏdrugtheraｐy,ＡDEＰT)關鍵是選擇適當的活化酶－前藥對。三、毒素偶聯的抗體藥物第一代免疫毒素是包具有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯物，其中B鏈非特異性結合，使其僅在體外應用。第二代免疫毒素是運用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內有一定的抗腫瘤作用。第三代免疫毒素：重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達。特異性好、穩定性強、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。制備方法：先克隆毒素基因,再運用基因重組技術去除毒素中非特異性細胞結合部位基因。經改造的毒素基因，再與載體基因重組，轉入受體菌中表達,形成融合蛋白，再通過純化就得到重組免疫毒素。４６.植物組織和器官的培養:植物無菌培養：（1）幼苗及植株的培養(2）愈傷組織培養（外植體,細胞聚集體）(3)懸浮培養（單細胞或小細胞團的液體培養）（４）器官培養(5）胚胎培養初級代謝產物:核酸、蛋白質、糖類外植體(脫分化)→愈傷組織(再分化)→生長點(形態發生）→芽、根→小植株４7.次級代謝產物:1.有明顯的分類學區域界線2.其生物合成需要在一定條件下才干發生3.缺少明確的生理功能4.是生命活動的多余成分重要有：生物堿、黃酮類、萜類、有機酸、木質素、皂苷類、多元酚類次級代謝作用是由特異蛋白質調控產生的內源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合過程。48．植物細胞培養的培養基的組成(１）無機鹽(2）碳源(3)植物生長調節劑（５種天然激素：生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯）（4)有機氮源（5)維生素。固定化反映器：網狀多孔板;尼龍網套；中空纖維膜優點:細胞位置固定，易于獲得高密度細胞群及維持細胞間理化梯度,利于細胞組織化，易于控制培養條件及獲得較高含量的次級代謝產物。49．影響植物次級代謝產物生產和累積的因素:１.生物條件:外植體，季節，休眠，分化2.物理條件:溫度,光(光照時間,光強，光質），通氣(O2),pH和滲透壓3．化學條件：無機鹽(Ｎ,Ｐ，Ｋ）,碳源,植物生長調節劑，維生素,氨基酸,核酸，抗生素，天然物質,前體4.工業培養條件：培養罐類型,通氣，攪拌和培養方法50.植物細胞大規模培養生物反映器的類型、及其性能比較1．機械攪拌式培養系統:根據植物細胞的特性,機械攪拌式生物反映器通常是在微生物發酵罐的基礎上改善設計的。優點：易于控制溫度、ｐH、溶氧及營養物質濃度，混合均勻。2.鼓泡塔生物反映器:反映器底部的噴嘴及多孔板實現氣體混合分散。優點:適于對剪切敏感的細胞的培養，無運動部件，不易染菌，相對高的熱量和質量傳遞,放大相對容易。缺陷：流體流動形式難以擬定,混合不勻，缺少非牛頓流體的流動與傳遞特性的數據。３．氣升式培養系統是最適合培養植物細胞的反映器之一。優點：低剪切力,較好的混合，較高的氧傳遞效果。無運動部件,不易染菌，操作費用低。缺陷:高密度培養時混合不均勻。4.轉鼓式生物反映器通過轉動促進反映器內氧及營養物的混合。優點:在高密度培養時有高的傳氧能力。缺陷:放大困難,大規模操作困難。５.固定化細胞生物反映器：指固定在載體(惰性基質)上,在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。采用固相培養，細胞有一定限度的分化發育，從而刺激調控代謝物合成的基因表達，促進次級代謝產物的產生。方法:吸附法（共價交聯，表面固定化，膜固定化）；包埋法(多孔載體，凝膠包埋）；材料:聚氨基甲酸乙酯泡沫,中空纖維素固定化植物細胞培養系統：平床培養系統立體培養系統51．植物細胞固定化培養優缺陷:１.可保護細胞免受剪切。２.細胞可長時間反復使用，更換培養基帶走代謝物。3．易于實現細胞的高密度培養。４．細胞間接觸良好,易于分化，有助于次級代謝產物的合成。５.減少細胞的遺傳不穩定性。6.易于實現連續化操作。缺陷:固定化培養的植物細胞其代謝產物必須分泌到細胞外,多數植物細胞次級代謝產物存在于細胞內或分泌到液泡中。52.植物細胞大規模培養程序：Ⅰ選材：培養器官、組織的選擇:取有藥效成分的部位,且該部位較易成愈傷組織。Ⅱ細胞株系建立:建立懸浮細胞繁殖體系（液體培養）。Ⅲ大量培養:將選出的優良細胞株擴大繁殖后,可作為細胞工廠化培養的生產“種子”,進行大量培養。Ⅳ產品提取與純化：從植物細胞培養物中提取和純化有用的產品。應用:大規模培養植物細胞;生產有用物質。53.植物生物反映器選擇標準①供氧能力及氣泡分散限度②剪切力大小及對細胞的影響③高密度培養時培養液的混合限度④溫度、ｐH及營養物質的控制能力⑤細胞團大小的控制能力⑥易于放大54.植物細胞制藥的進展與展望:①誘導子在植物細胞工程研究中的應用②前體飼喂③兩相法培養④轉基因技術在次級代謝產物生產中的應用⑤植物生物轉化技術與生物制藥５5.酶的特性酶是由活細胞產生的具有特殊催化功能的一類蛋白質。特點：①催化效率高②專一性強③反映條件溫和④催化活性受到調節和控制來源:（1）化學合成法,（2）從微生物中提取分離56.酶工程的研究內容：（1)酶的分離、純化、大規模生產和應用（2）酶和細胞的固定化及酶反映器的研究(傳感器,檢測器）（3）酶生產中基因工程技術的應用及遺傳修飾酶(突變酶)的研究（4)酶的分子改造與修飾,結構與功能的關系的研究(5）.有機相中酶反映的研究（6）酶的克制劑、激活劑的研究（７）抗體酶、核酸酶的研究（8）.模擬酶及酶分子的人工設計研究5７.運用微生物生產酶制劑的優點:1．微生物種類繁多,酶的種類齊全2.生長繁殖快,生產周期短,產量高３.培養方法簡樸,原料來源豐富，價廉經濟效益好4．微生物又較強的適應性，可通過基因工程哺育新的高產菌株５8.固定化酶的特點具有生物催化劑的功能,又有固相催化劑的功能。優點:①可多次使用。②反映后,酶、底物、產物易分開,產物中無殘留酶,易純化，產品質量高。③反映條件易控制,可實現轉化反映的連續化和自動控制。④酶的運用效率高。⑤比水溶性酶更適合于多酶反映。缺陷:①固定化時，酶活力有損失。②初始投資較大。③只能用于可溶性底物,并且分子量要小。④胞內酶必須通過酶的分離純化過程。⑤與完整菌體相比不適宜多酶反映，特別時需要輔助因子的反映。59.酶和細胞固定化方法與制備技術方法:①載體結合法、②交聯發、③包埋法、④選擇性熱變性法制備：⑴吸附法制備固定化酶技術⑵包埋法制備固定化酶技術①界面沉降法②界面聚合法⑶交聯法制備固定化酶技術⑷共價結合法制備固定化酶技術60．固定化細胞的特點有細胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點。優點:①無須進行酶的分離純化②保持酶的原始狀態，酶回收率高③細胞內酶比固定化酶穩定性高④細胞內酶輔助因子可自動再生⑤細胞自身含多酶體系,可催化一系列反映⑥抗污染能力強缺陷：①運用的僅是胞內酶,酶多副產物多②細胞膜、細胞壁和載體都存在擴散限制作用③載體形成的空隙大小影響高分子底物的通透性61.固定化細胞反映器的類型和特點⒈間歇式攪拌罐反映器:用于游離酶,反映后隨即放料,不回收游離酶。⒉連續流動攪拌罐反映器:連續進料、連續出料⒊填充床反映器:固定化酶填充于床層內。反映器內的流體的流動形態為平推流（活塞流)流形。⒋流化床反映器:底物以足夠大的流速向上通過固定化酶床層,使固體顆粒處在流化狀態，達成混合的目的。流速使固定化酶顆粒不下沉又不溢出。⒌循環反映器：部分反映液流出和新加入底物流入液混合，在進入反映床進行循環。⒍連續流動攪拌罐-超濾膜反映器:連續流動攪拌罐的出口處裝有超濾膜，產物和未反映的底物可通過，酶被截留反復使用。⒎其它反映器：6２.模擬酶的的概念及分類概念：人造的具有酶性質的催化劑（分子模擬立體結構,化學結構）特點：相對結構簡樸，高效,高催化性，蛋白質或非蛋白質分類:1.主-客體酶模型：2．膠束模擬酶3.肽酶:4.半合成酶:5.印跡酶：制備過程:1.使蛋白部分變性,擾亂起始蛋白的構象2.使印跡分子與之結合３.用交聯劑交聯印跡的蛋白質４.透析除去印跡分子63.酶的化學修飾的目的和意義:發明天然酶不具有的優良特性,擴大應用領域。提高生物活性,增長穩定性,擴展底物范圍６4．酶化學修飾的方法:1.酶的表面化學修飾:（1)大分子修飾。（２）小分子修飾。（3）交聯修飾。（4）固定化修飾。2．酶分子內部修飾:⑴非催化活性基團的修飾。⑵蛋白主鏈的修飾。(３）催化活性基團的修飾(４)與輔助因子有關的修飾：（5）肽鏈伸展后的修飾：3.結合定點突變的化學修飾。65.修飾酶的特性⑴熱穩定性提高⑵抗各類失活因子能力提高⑶抗原性消除⑷體內半衰期延長：⑸最適ｐH改變⑹酶學性質變化⑺對組織分布能力改變。66.酶化學修飾的應用及其局限性１.酶化學修飾的應用(1)酶結構與功能的研究(2）在醫藥方面的應用（3)在工業方面的應用2.酶化學修飾的局限性（1）某種修飾劑對某一氨基酸側鏈的化學修飾專一性是相對的。(2）化學修飾后酶的構象多少有些改變。(3)酶的化學修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側鏈上進行。（4）化學修飾法可以在酶結構與功能的研究方面提供信息,但是還不夠準確和系統。6７.酶的化學修飾的前景1．化學修飾可以改變天然酶各種活性，擴大酶的應用范圍?；瘜W修飾法是改造酶分子的有效方法,并且已有了一定的規律性和普遍性，具有廣泛的應用前景。2.化學修飾法并不合用于所有的酶，基因工程法，蛋白質工程法，人工模擬法,和某些物理修飾法可填補局限性。68.1.有機相酶反映的優點:（1）增長疏水性底物或產物的溶解性。(２）熱力學平衡向合成方向移動，如酯合成、肽合成(蛋白水解酶)。（3)可克制有水參與的副反映,如酸酐的水解等。(4）酶不溶于有機介質,易于回收再運用。(5)容易從低沸點的溶劑中分離純化產物。（6）酶的熱穩定性提高，ｐH的適應性擴大。(7)無微生物污染。（8)能測定某些在水介質中不能測定的常數。(９）固定化酶方法簡樸,可以只沉積在載體表面。(1０）酶在非水介質中可以催化某些在水中不能進行的反映(改變溶劑能控制底物的特異性、區域選擇性、立體選擇性),如脂肪酶水相催化酯的水解，有機相中催化酯化、轉酯、氨解等。2.有機相酶反映的溶劑體系(1）水-水溶性溶劑均相體系:乙醇、丙酮、甘油(2）水-水不溶性溶劑兩相體系:三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚(3）反向膠束（油包水酶)（４）單相有機溶劑體系：酶分子周邊有一層水分子膜（必需水)維持酶催化反映構象。３．水和溶劑對有機溶劑中酶的影響（1)酶活力：最適含水量。(2)酶選擇性:對固定的底物有些酶選擇性會因所處的溶劑不同而變化。（３)酶的穩定性：有機溶劑中酶的熱穩定性隨系統水含量增長而下降，水是酶熱失活的必須參與者。4.有機相的酶工程(1)酶的固定化：載體吸附法和凝膠包埋法，提高擴散效果,增長穩定性，利于回收和連續化生產(２)酶的化學修飾和表面活性劑包埋：增長酶表面疏水性，改善脂溶性和穩定性,提高催化效率。６９．酶工程優點：工藝簡樸、效率高、生產成本低、環境污染小、產品收率高、純度好。70．發酵工程的研究內容：生產菌種的培養和選育(菌種）培養基制備（培養基）發酵條件的優化與控制(攪拌通氣,溶氧，發酵過程參數控制，反映器的設計)產物的分離、提取與精制等(純化）菌種→工藝→設備71.優良菌種的選育一、菌種選育的物質基礎:DＮA二、自然選育：自發突變（正負)三、誘變育種：人工誘變四、原生質體融合：細胞融合，基因重組72.誘變育種(一)方法和原理1.誘變機制（1)微小損傷突變：堿基置換，碼組移動（2）染色體畸變：易位,逆位,缺失,反復（3）染色體組突變:數目變化（單倍體變多倍體）２.誘變劑：物理誘變劑，化學誘變劑,生物誘變劑（二)誘變和篩選初步篩選是關鍵環節１.自身耐藥突變株:耐受自身分泌的抗生素，提高產量2.結構類似物或前體類似物的耐受突變株：解除反饋克制3.營養缺陷型及其回復突變株３.營養缺陷型及其回復突變株通過誘變導致某些基因的突變，而需要添加一些物質（氨基酸、核苷酸等）才干生長的突變體。7３．營養缺陷型的作用:1解除末端產物的反饋調節作用。2作為標記，在雜交育種作為出發菌株有助于雜交重組的分析。3作為基因工程的受體菌，檢出克隆基因的表達。誘變涉及:出發菌株的選擇→誘變劑種類和誘變劑劑量的選擇→合理的使用方法篩選涉及：初篩→反復篩選→突變株性能檢測→直到獲得新的優良菌株。74．發酵方式一、分批(間歇)發酵:物料一次投入反映器中,滅菌、接種、發酵。特點:一次性;發酵過程中,營養不斷減少，微生物不斷增殖，環境非穩態；微生物生長的四個時期明顯。應用廣泛，需改善（在線檢測,計算機控制）。二、補料分批發酵：補加新鮮培養基。特點：可以解除底物克制、產物克制或克服微生物過度生長;提高有用產物的轉化率；應用廣泛,用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工業;三、連續發酵：恒化器、恒濁器,連續進料出料平衡，保持恒定的發酵液密度。優點：操作穩定;利于機械、自動化；提高設備的運用率;減少滅菌次數;易于過程優化。缺陷：易染菌；微生物易變異；對產品類型的適應性不廣;對設備及附件規定高。75.發酵工藝控制一、培養基的影響及其控制二、溫度的影響及其控制三、溶氧的影響及其控制四、pH的影響及其控制①培養基的影響及其控制1.碳源：糖類，脂肪，有機酸，碳氫化合物(速效碳源葡萄糖;遲效碳源淀粉,乳糖）2.氮源：無機氮源，有機氮源(速效氮源氨基酸,玉米漿;遲效氮源黃豆餅粉，花生餅粉、棉籽餅粉)。速效促生長,遲效利代謝。3.無機鹽和微量元素4.水5.發酵培養基的配制（1）提供必要的營養成分（2)配制合適的濃度(3)主成分與其他成分的配比（4)控制合適的pH。培養基的重要成分（１）碳源：①提供能源②菌體成分③產物碳架。（２）氮源①構成細胞物質②構成產物。(3)無機鹽及微量元素:①構成菌體成分②激活酶（Mg2＋）③輔酶或輔基的組成部分④參與能量轉移反映⑤調節滲透壓、ｐH、氧化還原電位。(４）特殊生長因子：①構成輔酶②促進生命活動。(5)水：①機體的重要組成成分;②參與一些代謝反映；③良好溶劑(介質)和熱導體；②溫度的影響及其控制影響發酵溫度變化的因素（1)生物熱：生長,呼吸,繁殖（2）攪拌熱：摩擦(3）蒸發熱：（4)輻射熱：罐內外溫差③融氧的影響及其控制④ｐH的影響及其控制7６.細胞破碎的方法及其優缺陷一、吸附法:優點:操作簡樸,成本低,缺陷：吸附不穩定,選擇性不高,不能連續生產,影響衛生,新型吸附劑（大孔樹脂）二、沉淀法:抗生素等電點沉淀或與酸、堿、離子形成復鹽沉淀析出，改變ｐH重新溶解。如土霉素,四環素,金霉素優點:設備簡樸，節省溶劑,收率高缺陷:過濾較困難三、溶劑萃取法:改變pH,改變溶劑,改變溶解度。優點:產品純度高,濃縮倍數大，能連續生產,周期短缺陷:溶劑耗量大,成本高，設備規定高四、離子互換法：帶負電荷的酸性抗生素用陰離子互換樹脂:萬古霉素,桿菌肽帶正電荷的堿性抗生素用陽離子互換樹脂:鏈霉素,卡那霉素，巴龍霉素,慶大霉素。優點:設備簡樸,節省溶劑,操作方便缺陷：ｐH變化大，周期長７7.抱負的微生物細胞生物反映器的基本規定:(１)．生物反映器的材料無毒，穩定性好，一般用不銹鋼制成(2).生物反映器的結構:滿足傳質、傳熱、混合的功能(３).密封良好，避免污染（4)．自動檢測、調節控制精度高（５）.攪拌器轉速和通氣應適當（６）.容器內表面光滑,無死角,利于清潔、滅菌（7).拆裝、連接、清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒(8).設備成本低78．基因工程在發酵工程中的應用①基因工程在抗生素生產中的應用克隆抗生素生物合成基因的策略和方法:（1)在標準宿主系統中克隆檢測單基因產物（鳥槍法）(2）阻斷變株法（３)突變克隆法：基因重組（４)直接克隆法:克隆整套生物合成基因,如頭霉素C（5）克隆抗生素抗性基因法：抗性基因與合成基因連鎖（６)寡核苷酸探針法：(7）同源基因雜交法：結構類似的抗生素有同源的生物合成基因。3、提高抗生素產量（1)增長參與生物合成限速階段基因的拷貝數(2)通過調節基因的作用(3）增長抗性基因4、改善抗生素的組分5、改善抗生素生產工藝:克隆血紅蛋白基因到抗生素產生菌中,提高細胞氧的運用率。6、產生雜合抗生素(1)生物合成途徑中某個酶基因突變(2)引入一個酶基因(3)運用底物特異性不強的酶催化形成新產物7、組合生物合成:微生物次級代謝產物合成是多酶體系參與的,特點是:（1)通過多個催化功能的組合完畢復雜化合物的合成（2）化合物為天然產物（3）合用于化學合成困難的復雜化合物②在氨基酸生產中的應用③在維生素生產中的應用79．基因工程菌的遺傳不穩定性的兩種重要表現形式是什么?重要機制是什么?

答:基因工程菌的遺傳不穩定性重要表現在重組質粒的不穩定性,這種不穩定性具有下列兩種表現形式:１.結構不穩定性：重組DNA分子上某一區域發生缺失，重排,修飾,導致其表觀生物學功能的喪失２.分派不穩定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸.

基因工程菌的遺傳不穩定性的產生機制：1.受體細胞中的限制修飾系統對外源重組ＤＮA分子的降解2．外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝3.重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分派，這是重組質粒逃逸的基本因素4.受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排

80.在人胰島素AＢ鏈分別表達法中，為什么將AB鏈編碼序列與b－半乳糖苷酶基因融合？

答:小分子蛋白在大腸桿菌中表達后不穩定,容易被細胞內蛋白酶降解失活．表達融合蛋白的優點是基因操作簡便;在菌體內比較穩定,不易被細菌酶類所降解，容易實現高效表達.人胰島素ＡB鏈分別表達法中,將Ａ,B鏈編碼序列與ｂ-半乳糖苷酶基因融合,分別表達出融合蛋白,使表達的蛋白分子量足夠大,避免被蛋白水解酶分解,提高其穩定性及表達率．?8１．闡述基因工程藥物研制有那些重要過程??答：基因工程藥物的生產必須一方面獲得目的基因,然后用限制性內切酶和連接酶將所需目的基因插入適當的載體質粒或噬菌體中并轉入大腸桿菌或其他宿主菌(細胞)，以便大量復制目的基因.對目的基因要進行限制性內切酶和核苷酸序列分析.目的基因獲得后,最重要的就是使目的基因表達.基因的表達系統有原核生物系統和真核生物化的難易．將目的基因與表達載體重組,轉入合適表達系統，獲得穩定高效表達的基因工程菌。建立適于目的基因高效表達的發酵工藝，以便獲得較高產量的目的基因表達產物.。建立起一系列相應的分離純化,質量控制，產品保存等技術．

82.對鼠源性單克隆抗體進行改造的目的是什么?鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類型？?答:對鼠源性的單抗進行基因加工和改造，可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結合特異性。可消除免疫源性。減少相對分子量。(1)人-鼠嵌合抗體:將鼠MAb的可變區和人抗體的恒定區組成嵌合抗體由于這兩部分在空間結構上相對獨立,其獨特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區的存在，應用時仍有較強的排斥反映.?(2)改形抗體:在嵌合抗體的基礎上進一步將鼠MAｂ可變區中相對保守的ＦＲ替換成人的FR,保存與抗原結合的ＣDR部位?（3)Fab抗體：Ｆab段由重鏈Ｖ區及CH1功能區與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，重要發揮抗體的抗原結合功能.Faｂ抗體只有完整IgG的1/3.

(4）單鏈抗體:單鏈抗體是由一段彈性連接肽把抗體可變區重鏈與輕鏈相連而成,是具有親代抗體所有抗原結合特異性的最小功能結構單位.

(５)單域抗體：只含Ｖ區基因片段的小分子抗體,即只有VH或VL一個功能結構域，也能保持原單克隆抗體的特異性．這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區抗體,其分子量僅為整個Ig分子的1/1２.?(6)分子辨認單位:只具有一個CDR多肽的抗體.。８3．抗體治療藥物有哪些？答：以抗體為載體的導向治療藥物一、放射性同位素標記的抗體治療藥物:抗體作為放射性核素的導向載體，標記操作簡便，用量小。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。二、抗癌藥物偶聯的抗體藥物：⒈常用的抗癌藥物氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MＴX量，使體外細胞毒性提高二倍。⒉抗體類藥物逆轉耐藥性。3.抗體導向酶-前藥療法關鍵是選擇適當的活化酶-前藥對。三、毒素偶聯的抗體藥物:在導向藥物中，毒素和抗體的交聯物稱為免疫毒素。第一代免疫毒素是包具有Ａ、Ｂ鏈完整毒素和抗體的交聯物，其中B鏈非特異性結合，使其僅在體外應用。第二代免疫毒素是運用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內有一定的抗腫瘤作用。第三代免疫毒素:重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達。特異性好、穩定性強、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。制備方法：先克隆毒素基因,再運用基因重組技術去除毒素中非特異性細胞結合部位基因。經改造的毒素基因,再與載體基因重組，轉入受體菌中表達，形成融合蛋白,再通過純化就得到重組免疫毒素。１.生物技術的四大支柱:基因工程、_細胞工程、＿酶工程_和發酵工程。2．據記錄，人類的遺傳病有6000多種，患者約占總人口的15%,近年來平均每年還要增長10０多種新探明的遺傳性綜合癥；這些疾病歸根到底都跟＿基因_有關,理論上都可以在基因水平上找到的防止、診斷和治療方法。3.19８２年,世界上第一個基因工程藥物

＿胰島素投放市場；19９2年,我國第一個基因工程藥物

_rＨUＩＦＮαIｂ_上市;目前國際市場上銷售最佳的基因工程藥物涉及:_促紅細胞生成素ＥPO、＿粒細胞集落刺激因子_、_重組白細胞介素_、_重組人干擾素＿等。4.生物技術藥物大體上可以分為：蛋白質藥物和_多肽藥物＿;5.根據目的的不同，載體可分為克隆載體_和_表達載體_;尚有一種載體可以在兩種宿主系統里復制或表達,稱為穿梭載體,如:大腸桿菌－酵母穿梭載體、大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體。６．基因工程菌的培養方式有：補料分批培養、連續培養、透析培養、固定化培養＿。核酸類藥物涉及:_抗病毒劑_、_抗腫瘤劑_、干擾素誘導劑_、免疫增強劑等。7.作為一個表達載體至少具有的4個元件:多克隆位點、選擇標記、復制起點和啟動子。8．目的基因在大腸桿菌中的表達方式：包涵體異源蛋白表達,分泌性表達和融合型異源蛋白表達三種。9.按照生長特性,動物細胞細胞可分為_貼壁細胞_、__懸浮細胞_、兼性貼壁細胞；中國倉鼠卵巢細胞（CHＯ)屬于_兼性貼壁細胞_。10.根據目的的不同，載體可分為克隆載體_和_表達載體_;尚有一種載體可以在兩種宿主系統里復制或表達,稱為穿梭載體，如:大腸桿菌-酵母穿梭載體、大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體。11．重要的動物生物反映器有:攪拌罐式生物反映器、氣升式生物反映器、固定床式生物反映器;此外,袋式或膜式生物反映器、中空纖維式生物反映器、可同時制備巨載體和微囊等固定化培養的生物反映器。12.植物細胞大規模培養生物反映器的類型有：機械攪拌式生物反映器、鼓泡塔生物反映器、氣升式生物反映器、轉鼓式生物反映器、固定化細胞生物反映器。１3.多功能抗體構建方法:化學交聯法、生物學方法(雜種－雜交瘤）、基因工程法1４．植物細胞大規模培養系統：成批培養法、半連續培養法、連續培養法、固定化培養法1５.酶在醫藥領域的應用1.疾病診斷：2.疾病治療:３.藥物生產:４.分析檢測:16.固定化細胞的制備技術載體結合法、包埋法、交聯法、無載體法１7.細胞破碎的方法有機械、生物和化學等各種方法。

B補料分批培養：是將種子接入發酵反映器中進行培養,通過一段時間后間歇或連續地補加新鮮培養基(溶氧控制、流加補料)，使菌體進一步生長的方法。良好的生長環境，延長對數生長期，獲得高密度菌體。C次級代謝作用:是由特異蛋白質調控產生的內源化合物的合成