液相色譜（反相)-脈沖安培檢測對硫酸依替米星的分析

一.摘要二.引言及基本介紹三.實驗四.結果與討論五.結論一.摘要一種對于依替米星純度和含量的檢測的方法是通過液相色譜-脈沖安培檢測。流動相是由0.033mol/L草酸，0.012mol/L七氟丁酸，和通過稀NaOH溶液調節成pH3.4的乙腈溶液所組成。總分析時間不超過30分鐘。本實驗對于分離時不同的色譜參數也進行了調節，并運用這種方法對大量的硫酸依替米星的商業樣品進行了分析。二.引言和基本介紹1.依替米星簡介2.氨基糖苷類的檢測方法3.脈沖安培檢測（PAD）簡介1.依替米星簡介依替米星，是一個通過化學修飾慶大霉素的C1a而獲得的新的半合成的水溶性的氨基糖苷類抗生素，對氨基糖苷類和類似的奈替米星耐藥的革蘭氏陽性和陰性菌均有活性。依替米星的耳毒性和腎毒性大體上比其他的氨基糖苷類低，比其他的奈替米星類更低（耳毒性為奈替米星的1/2，丁胺卡納的1/7；腎毒性為奈替米星的1/12，丁胺卡納的1/17）。然而，依替米星的治療范圍窄并且要小心得檢測在血液中的水平。1.依替米星簡介依替米星是慶大霉素的C1a的1-N-乙基衍生物。因此，慶大霉素C1a是可能的一種雜質。還有慶大霉素C1a的衍生物3”-N-乙基（ETM-1)和1,3”-N-乙基”(ETM-2)，和一些中間體如3,2,6-N-乙酰基-慶大霉素)和1-N-乙基-3,2,6-N-乙酰基-慶大霉素(P2)有微弱的抗菌活性。這幾種物質就是下面的實驗中進行檢測的主要物質，結構式如下：1.依替米星簡介2.氨基糖苷類的檢測方法在過去的幾年中出現了大量的檢測氨基糖苷類抗生素的方法，包括微生物檢測，免疫測定，毛細管電泳，薄層色譜法，氣液色譜，利用紫外檢測的柱前衍生化的高壓液相色譜，電化學，質譜法。依替米星有氨基糖苷類的結構，以上提到的方法也應當可以運用。（有興趣的話自己下去學）由于柱前衍生化是不方便的，耗時的并且定量的時候有一些問題或者導致不穩定的衍生，電化學檢測尤其是脈沖安培檢測是更好的。3.脈沖安培檢測簡介安培檢測器由恒電位器和三電極電化學池組成。三電極就是工作電極、參比電極和對電極，在工作電極和參比電極之間施加的是發生氧化反應或者還原反應所需的電位，稱為施加電位或者工作電位。在工作電位上施加階躍電位的稱為脈沖安培法。脈沖安培檢測在實驗中需要使用三階電位，Εdet,Εoxd和Εred，因此必須設定各脈沖的幅度和間隔時間。3.脈沖安培檢測3.脈沖安培檢測簡介可用于安培檢測的物質需具有電化學活性，并較易發生電化學氧化還原反應。電化學檢測靈敏度高，具有很好的選擇性。特別是對于那些不具有紫外-可見或熒光生色團的物質的檢測，脈沖安培檢測是一個很好的補充手段。3.脈沖安培檢測簡介通常，溶液的pH值對電化學反應的影響很大，如果反應過程中有H+或者OH-的參與，其氧化還原電位和檢測靈敏度將隨pH值的不同而變化。當流動的酸堿度不能達到檢測所需的最佳pH時，可在分離柱和檢測器之間通過柱后加入適當的溶液進行調節，以保證檢測的靈敏度。3.脈沖安培檢測檢測液相色譜-電化學檢測技術不能取代常規的紫外-可見檢測，但卻是一個重要的補充手段，特別是那些不具有生色基團，不能用紫外-可見吸收有效檢測的物質尤為需要。三、實驗在這里主要講實驗中的色譜方法。流動相是由0.033mol/L草酸，0.012mol/L七氟丁酸，和通過稀NaOH溶液調節成pH3.4的乙腈溶液所組成。使用之前要用0.45微米的過濾器和超生進行過濾，流速是每分鐘一毫升。所有被分析的物質都要溶解到流動相中。為了進行脈沖安培檢測，0.52mol/L的氫氧化鈉通過一個混合型三通從氮氣加壓水庫加入到柱后并且混合到填充反應管。加入的酸的流速是不重要的，但他在流動過程中應該是重復的并且是沒有脈沖的。將流動相的pH提高到大約13來增加檢測的靈敏度是必要的。三、實驗對于脈沖安培檢測時間和電壓參數設置如下：E1為0.12V;E2為0.70V；E3為-0.60V。t1為0-0.4秒；t2為0.41-0.60秒；t3為0.61-1秒。信號的整合是在0.2-0.4秒。四、結果和討論1.色譜條件的選擇2.波形優化和電極穩定性3.液相色譜的定量方面4.商業樣品的分析1.色譜條件的選擇分離依替米星和它的相關物質的不同色譜參數的影響用保留時間和分辨率進行評估。保留時間指被分離樣品組分從進樣開始到柱后出現該組分濃度極大值時的時間，也即從進樣開始到出現某組分色譜峰的頂點時為止所經歷的時間，稱為此組分的保留時間，用RT表示，常以分（min）為時間單位。保留時間是由色譜過程中的熱力學因素所決定，在一定的色譜操作條件下，任何一種物質都有一確定的保留時間，有著類似于比移值相同的作用，可作為色譜定性分析的依據。1.色譜條件的選擇在流動相中增加乙腈的數量和乙腈濃度的些許不同而使得保留時間減少有著顯著的影響。為檢查草酸量的影響，草酸在流動相中的濃度是按照下面的濃度進行變化的：0.025,0.028,0.033和0.036mol/L。在檢查的范圍內，草酸的量對保留時間沒有顯著的影響。用pH2.5—4.5的緩沖液來檢測流動相pH的影響。pH在3-4幾乎沒有影響。隨著進一步降低或者增加pH，保留時間就減少。（見下圖）1.色譜條件的選擇1.色譜條件的選擇七氟丁酸的濃度在0.0074-0.015mol/L時對保留時間沒有影響，隨著七氟丁酸的增加，保留時間增加了很多。在柱溫的影響方面檢測了35,40和45度。正如預期的那樣，當柱溫增加的時候保留時間就減少了（和粘度有關，由于溫度升高，粘度減小，所以保留時間減少）。2.波形優化和電極穩定性電流-電壓的伏安響應曲線被用來篩選電壓的檢測操作條件。這些展示在下圖中。（虛線是參比溶液，實線是依替米星樣品）測依替米星時在金電極表面的氧化出現在0-0.4V。參比溶液在這個區域幾乎沒有陽離子電流。參比溶液的電化學響應是由于在E大于0.4V時表面氧化物的形成和E大于0.7V時氧氣析出。循環的伏安數據表明依替米星的脈沖安培檢測-液相色譜時工作電位應當設置到0-0.4伏。2.波形優化和電極穩定性2.波形優化和電極穩定性下圖顯示了背景的一個情節，依替米星的響應對應著測量工作電壓。背景反應和依替米星反應的最大差出現在大約0.12V。這是工作電壓在最后方法條件時的電壓。檢測時E1=0.12V的信號-噪聲比是3250，這比其他檢測電壓時的比值更大。2.波形優化和電極穩定性2.波形優化和電極穩定性雖然理論上的電位序列清洗了電極表面，為獲得好的重復性金的工作電極在分析60次后是有必要進行磨光的。在電極用精細拋光化合物清洗后，應當在水中超生10分鐘。在同一時間用紙巾清除計數電極和參考電極的沉積物質是合適的。3.液相色譜的定量方面依替米星和相關物質的線性是在0.005-0.125mg/mL的濃度范圍內檢測出來的。結果在表1中。其中y是峰面積，x是注入標準溶液的濃度（mg/mL），r是相關系數。可重復性是分析0.05mg/mL的每一個化合物的標準溶液六次，峰面積的RSD在表1中。3.液相色譜的定量方面4.商業樣品的分析三個商業的硫酸依替米星，從三個不同的產商獲得，用所描述的方法進行了分析。將得到的樣品的組分展示在表2中。所有較小的成分都用依替米星的相對數量來表示，用檢測商業樣品的百分之5的稀釋液獲得色譜圖。結果發現ET2是主要的雜質，沒有用其他的方法進行檢測。可以看出，依替米星樣品的組成是依賴于原始的樣品的。同