流式細胞術的應用

（FlowCytometry,FCM)解放軍總醫院生化科高艷紅1、流式細胞儀(FlowCytometer):是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學，單抗技術為一體的高科技細胞分析儀。2、流式細胞術(FlowCytometry):利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術。基本概念EPICSXL流式細胞儀電源箱自動進樣器流式細胞儀主機流式細胞儀工作站流式細胞儀的基本原理流式細胞儀的應用流式細胞儀的操作內容流式細胞儀結構

流動室及液流驅動系統:鞘液激光光源及光束形成系統:透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源光電管和檢測系統：收集不同波長的熒光信號，光電倍增管（PMT）、補償電路，熒光信號轉換為電信號，并將信號放大計算機和分析系統流式細胞儀的主要技術指標1．流式細胞儀的分析速度：

一般流式細胞儀每秒檢測1000～

5000個細胞,大型機可達每秒上萬個細胞。2．流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區分。3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。4．流式細胞儀的分辨率：通常用變異系數CV值來表示，,一般流式細胞儀能夠達到<2.0%,這也是測量標本前用熒光微球調整儀器時要求必須達到的。5．流式細胞儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。

流動室（flowcell）InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid光路激光 根據被激發物質的激發光譜而定

濾片長通濾片

–

允許長于設定波長的光通過短通濾片–

允許短于設定波長的光通過帶通濾片–

允許一定帶寬的波長的光通過帶阻濾片–

阻擋一定帶寬的波長的光通過二向色性濾片(dichroicfilter)：當以45o

角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光。

常用熒光染料的特性熒光染料激發波長(nm)發射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670PMTPMTPMTPMT4DichroicFiltersBandpassFiltersFlowCytometryPrincipleLaser1234Flowcell檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側向角散射光(90度散射光)熒光信號熒光染料光學濾片

散射光信號—前向散射光(FS)FSForward(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器FS的強度主要與細胞或其他顆粒的大小有關FALSSensorLaser前向散射光

散射光信號–側向散射光SS-Side(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側向檢測器,也稱為90度散射光檢測器SS反映被測細胞的細胞膜、細胞質、核膜的折射率和細胞內顆粒的性狀，SS的強度與細胞或其他顆粒的顆粒度有關FALSSensor90LSSensorLaser側向散射光熒光染料比較(平均熒光強度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC

二、流式細胞術的應用細胞增殖周期測定和DNA倍體分析凋亡檢測免疫功能的檢測血液學應用HLA-B27的檢測：用于診斷強直性脊柱炎其他：溶液中細胞因子的測量細胞分選

細胞增殖周期測定和DNA倍體分析1）細胞增殖周期：分為G0、G1、S、G2、M期。FCM分析一個群體細胞峰DNA倍體與細胞周期時，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1,S,G2/M期三個細胞峰。G0/G1和G2/M細胞峰DNA的含量成正態分布，S期細胞峰則是一個加寬的正態分布。2）利用DNA的熒光染料，如PI（Propidiumiodide碘化丙啶），與細胞內的DNA結合，可反映細胞內DNA含量。采用DNA直方圖顯示。具有2CDNA含量細胞為G0/G1期細胞，4CDNA含量細胞為G2/M期細胞，DNA含量介于兩者之間的細胞為S期細胞。3）DNA倍體：主要比較G0/G1期細胞DNA含量的變化。用DNA指數（DI）表示。DNA指數=測量樣本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴細胞G0/G1期DNA含量以正常人淋巴細胞作為對照。正常細胞DNA指數為1.00，DNA指數＞1，為超2倍體，＜1為亞2倍體，兩者可統稱為非整倍體。非整倍體細胞中腫瘤的特異性標志，實體腫瘤中出現頻率較高。凋亡檢測1）FCM-DNA檢測（DNA亞G1峰的檢測）：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數。其原理為在凋亡過程中，細胞內核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內降解的DNA片段從細胞內流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。注：檢測的凋亡細胞數代表晚期的凋亡細胞比例，且易受標本中的死細胞和碎片的干擾，影響結果的準確性。2）DNA鏈損傷“TUNEL”法3）Annexin-V-FITC/PI雙染法4）線粒體細胞膜電位的檢測5）凋亡相關基因的檢測——免疫標記法檢測基因免疫功能的檢測（1）利用多參數流式細胞術，對PB中淋巴細胞比例，及淋巴細胞中T、B、NK細胞的比例，及T細胞亞群進行檢測。如CD3+（總T細胞）；CD19+（總B細胞），CD3-/（CD16+5（NK細胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：輔助/誘導；CD3+/CD4+/CD5RA+：na?ve輔助/誘導T細胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：記憶性輔助/誘導T細胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/殺傷；CD3+/CD8/45RA+：na?ve抑制/殺傷T細胞；CD3+/CD8+/CD45R0+：記憶性抑制/殺傷T細胞。胞內細胞因子的檢測：CD4+/IL-4+，Th1細胞，CD4+/IFN-γ+。（2）臨床應用：原發性或繼發性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤療效觀察與預后判斷、移植免疫檢測等。是白細胞（包括血小板、血管內皮細胞等）在正常分化成熟的不同階段以及活化過程中在這些不同譜系（lineage）細胞胞漿或細胞膜表面出現或消失的標記，參與機體重要的生理和病理過程。八十年代在WHO和國際免疫學聯合會(IUIS)組織下，將識別同一分化抗原的來自不同實驗室的單克隆抗體歸為一個分化群.白細胞分化抗原-CD分子(Clusterofdifferentiation)

CD抗原及其相關細胞群

細胞群CD抗原

T細胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B細胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75

髓系細胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK細胞CD16CD56CD57CD94

血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63

激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97

粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f

內皮細胞CD105CD106CD109細胞因子受體CD25CD115CD117CD122CD126

1.評價機體的免疫功能(1)淋巴細胞亞群

T細胞：CD3+CD4+(Th/Ti)CD8+(Ts/Tc)B細胞：CD19+NK細胞：CD3-CD16+CD56+(2)淋巴細胞亞群細分

T細胞：Ts：CD8+CD28-Tc：CD8+CD28+Th：CD4+CD29+Ti：CD4+CD45RA+B細胞：B1：CD5+CD19＋B2：CD5－

CD19+

CD4+:Th1:CD4+IFNr+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFNr+IL4+

CD8+:Tc1:CD8+IFNr+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFNr+IL4+根據T淋巴細胞分泌細胞因子的不同分為輔助性T細胞亞群的生物學功能及臨床意義Th1細胞：介導細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導遲發型過敏反應。其功能亢進將導致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應和接觸性皮炎等的發病和免疫病理損傷。Th2細胞：介導體液免疫，促進B細胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉換因子，其功能亢進將導致特異性過敏反應，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。Th1/Th2細胞平衡偏移多見于：感染癥、自身免疫病、過敏癥、排斥反應、免疫缺陷、腫瘤惡化等。檢測Th1/Th2細胞平衡主要是分析疾病發生發展的狀況，為臨床調整Th1/Th2細胞平衡偏提供正確的治療依據。

(3)活化淋巴細胞亞群

活化總T細胞：

CD3+/HLA—DR+

早期活化T細胞（CD4/CD69/CD8）

活化T細胞（CD25/CD3）

活化T細胞亞群（CD4/CD25/CD8）

或（CD4/HLA-DR/CD8）HLA-DR、CD69、CD25是T細胞活化各個時期表達的標志性抗原，對其進行檢測可以判斷出疾病的進程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預后和治療(8)機體免疫功能監測的應用自身免疫性疾病HLA-B27:強直性脊柱炎相 關標志變態反應性疾病CD23:與變態反應嚴重程度 呈正相關免疫缺陷性疾病感染性疾病(病毒、細菌、寄生蟲感染)

免疫治療監測腫瘤免疫監測移植免疫監測HLA-B27檢測的臨床意義強直性脊柱炎陽性率90%以上

Reiter’s綜合癥70-90%

銀屑病性關節炎50-60%

葡萄膜炎40-50%

普通人群5-10%FCM在臨床血液學中的應用1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前對白血病和淋巴瘤的診斷，國際上提出MIC分型，即通過形態（M）、免疫分型（I）、細胞遺傳學（C）檢測，對白血病和淋巴瘤進行綜合診斷，免疫分型是重要的檢測項目之一。現在多應用多參數的流式細胞術，不同抗體分別被幾種熒光素標記：第一熒光（FL1）：FITC（異硫氰酸熒光素，Fluorescein

isothiocyanate），FL2：PE（藻紅蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黃素葉綠素蛋白，peridininchlorophyllprotein），FL4：APC（別藻蘭蛋白allophycocyanin,）

能正確區別AML和ALL，并能進一步區別

ALL中的T系和B系及亞型。能正確鑒別AML中的M0、M6、M7

診斷雙系或雙表型白血病發現僅表達個別次要非本系列相關抗原的白血病診斷少見疑難白血病(如毛細胞性白血病)免疫分型的價值白血病免疫分型診斷標準 (EGIL)標準B淋巴系白血病Pro-B-ALL(BⅠ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+CommonALL(BⅡ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CD10+Pre-B-ALL(BⅢ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，CyIgM+成熟-B-ALL(BⅣ型)：CD19+，或/和CD22+，或/和CD79a+，Kappa/Lambda+急性髓性白血病(AML)AML中，M0M6M7可以通過免疫分型確診診斷白血病主要標志：B-ALL: CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL: CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML: CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO

M3:CD34-,HLA-DR- M2:CD19+:t(8,21) M4/M5:CD14+ M6:GlyA+,CD71+ M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+2）CD34+造血干/祖細胞的檢測。主要用于干細胞移植及基因治療方面的檢測。3）活化血小板及網織血小板的檢測，在栓塞性疾病，如腦血管和心肌梗塞的患者，可出現活化的血小板增多。而血小板減少的患者，如果出現網織血小板增多，則說明血小板減少的原因為血小板破壞過多所致。4）陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）的發病機制為X染色體上的PIG-A基因發生突變，引起糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實的GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診斷的主要為CD55和CD59兩種，如果在紅細胞或WBC上出現CD55或/和CD59的減少，可診斷為PNH。5）網織紅細胞計數6）白細胞分類計數2.白血病的耐藥基因(MDR)檢測

MDR表達產物—P糖蛋白(P-gp)P-gp的作用機理

P-gp在白血病檢測中的臨床意義3.白血病的其它檢查(1)細胞凋亡的檢查

Fas及FasLApo2·7bcl-2P53

AnnexinⅤ

Caspase(半胱氨酸蛋白酶)(2)細胞DNA分析(3)白血病殘留病灶檢查(MRD)細胞分選

FCM可將樣本中所需要的細胞亞群從群體細胞中分離出來，即所謂分選(Sorting)。被測細胞的任何參數均可作為分選的依據。分選的方式一般有靜電分選和捕獲管分選，分選方式不同則決定分選的速度，分選純度一般可達99%以上。除細胞分選外還可進行染色體分選。分選的細胞可用于克隆化培養、原位雜交、分子生物學研究等。從孕婦外周血中分離富集胎兒有核紅細胞用于產前診斷，染色體分選可用于基因診斷。三、操作方案PROTOCOL選定參數構建直方圖區域，GATE，閾值，電壓和增益，補償條件。FCM的主要測定指標FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中：

FSC：反映細胞的大小

SSC：反映細胞內顆粒性FCM標記方法單標：一種單抗/tube:FL1,FSC,SSC（三參數）雙標：（兩種單抗/tube）：FL1,FL1,FSC,SSC（四參數）三/四標：（三種單抗/tube）（四種單抗/tube）： FL1-FL3/4,FSC,SSC熒光素種類FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發

PE最強，適用于弱表達抗原

FITC最便宜，適用于強表達抗原，適用范圍廣

biotin-avidin不適合弱抗原的檢測抗體的選擇數據顯示方式單參數直方圖雙參數二維點圖等高圖二維密度圖三維圖流式常見圖形(HistogramPlot)適用于：單參數分析流式常見圖形(DotPlot)適用于：多參數分析抗體的選擇首選直接標記抗體熒光分子