質粒操作（提取、酶切、電泳）細菌DNA提取細菌間基因重組講課內容：一、細菌核酸的基本知識1、染色體主要遺傳成分，攜帶基本代謝的全部基因，呈共價閉合環狀(CovalentlyClosedCircle，簡稱CCC)

，一般只有一條，在細胞中以緊密纏繞成的較致密的擬核(nucliod)，其上結合有類組蛋白蛋白質和少量RNA分子，使其壓縮成一種手腳架形的致密結構。生物分子量（Da）堿基對約數長度（mm）蛙—2.3×10106700人—3×109870果蠅—8×10724脈孢菌2.8×10104.5×107—大腸桿菌2.5×1094.6×1061.5噬菌體T21.3×1083×1050.056λ噬菌體3.2×1075×1040.016多瘤病毒3×106——染色體上編碼各種功能的基因比例,%

編碼的功能)大腸桿菌(Escherichiacoli)流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)生殖道枝原體（Mycoplasmagenitalium）代謝21.019.014.6結構5.54.73.6運輸10.07.07.3調節8.56.66.0翻譯4.58.021.6轉錄1.31.52.6復制2.74.96.8已知的其他8.55.25.8未知38.143.032.02、質粒一種獨立于染色體外，能進行自主復制的細胞質遺傳因子。通常以共價閉合環狀的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞中；質粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；（細菌質粒多在10kb以內）（1）宿主細胞染色體DNA分子量明顯大于細胞所含質粒DNA分子量，如大腸桿菌（Escherichiacoli）染色體的DNA分子為4.6×103kb左右，而通常用于基因工程中的載體一般均小于10kb，1~100×106Da。（2）質粒所攜帶的遺傳信息量較少。攜帶的遺傳信息所一般只與宿主細胞的某些次要特性有關，而并不關系到細胞的生死存亡。

微生物質粒DNA與染色體DNA差別在于：質粒具有下列特性：①

可轉移性。即某些質?？梢约毎g的接合作用或其它途徑從供體細胞向受體細胞轉移。②

可整合性。在某種特定條件下，質粒DNA可以可逆性地整合到宿主細胞染色體上，并可以重新脫離。③可消除性。經某些理化因素處理如加熱、或加入丫啶橙或絲裂霉素C、溴化乙錠等，質?？梢员幌?。

高拷貝數(highcopynumber)質粒（每個宿主細胞中有10-100個拷貝）

———————松弛型質粒(relaxedplasmid)低拷貝數(lowcopynumber)質粒（每個宿主細胞中有1-4個拷貝）

———————嚴謹型質粒(stringentplasmid)窄宿主質粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細胞中復制）廣宿主質粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細菌中復制）質粒的相容性：不同質粒在同一宿主細胞內的共存性。有一個復制起始點，能自主復制；具有明顯的篩選標記，如：

（1）Ampr水解β－內酰胺環，解除氨芐的毒性。

（2）tetr可以阻止四環素進入細胞。

（3）camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶使G418（長那霉素衍生物）失活

（5）hygr使潮霉素β失活。

有克隆位點（MCS外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量盡量小，以容納較大的外源DNA?；蚬こ藤|粒載體的特點本來不能在含青霉素的平板上生長的受體菌在轉化子（含有Ampr質粒）周圍形成衛星菌落（b-內酰胺酶分泌到胞外所致）克隆載體：pUC18/19

注意：藍白斑需要誘導啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。純化標簽His-tag和S-tag凝血酶切點藍白斑篩選需要誘導廣宿主載體pBBRMCS系列

復制起始位點通用

Mob負責接合轉移藍白斑無須誘導自殺性載體pSC123

復制起始位點需要特殊蛋白結合

TraJ負責接合轉移Mariner負責跳躍pBK-CMV：原核、真核雙元表達載體反向篩選標記NucleicAcidResearch,2006,IF:7.552二、針對質粒和總DNA的操作質粒的提取總DNA的提取質粒或DNA片段的酶切酶連電泳酶切產物的回收1.質粒的提取溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)；溶液II:0.2mol/LNaOH,1%SDS(現配現用)；溶液III:乙酸鉀溶液(3M,pH=4.8)(60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2O)；RNaseA：10mg/ml；TE緩沖液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0。1挑取轉化篩選的帶有目的質粒的大腸桿菌接種到液體培養基中，37℃震蕩培養12～16小時；2將1.5mL菌液加入Ep離心管中，12000g離心30Sec，棄上清液，在吸水紙上扣干；

離心時間不能太長，以免影響下一步的菌體懸浮3加入100L預冷的溶液I，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細菌細胞，盡量使細胞分散；

溶液I中的葡萄糖的作用是增大粘度，減少提取過程中的機械剪切力，防止染色體DNA的斷裂；EDTA的作用是與二價離子（Ca2＋）結合，降低DNase對DNA的降解。4加入200L新配制的溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管,以混勻內容物,冰上放置3－5min;

溶液II中的NaOH與SDS可裂解細胞，使DNA變性以及SDS使蛋白變性并形成交聯的網狀結構

5加入150l溶液III,加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置2～3min；

溶液III為低pH的醋酸鉀緩沖液，中和NaOH，以便使變性的閉環質粒復性，而細菌染色體DNA不能正確復性612000g離心6min，將上清移入另一干凈的Ep管中7加2倍上清體積(約1mL)的無水乙醇,振蕩混勻，室溫放置2min.812000g離心10min，棄上清液，再用70％的乙醇洗滌一次，12000g離心1min，離心管倒置于吸水紙上扣干，然后在真空濃縮系統上干燥質粒；9加入40L含20g/mLRNaseA的滅菌蒸餾水或TE緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質粒完全溶解(約8min)，存于－20℃或直接用于酶切。細胞破碎抽提去蛋白質沉淀核酸2.總DNA的提取基本原理和過程：①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學試劑法：用SDS處理細胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。細胞破碎

SDS：SDS是有效的陰離子去垢劑,細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,SDS能夠破壞這種價鍵。CTAB：CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細胞中的DNA-蛋白質復合物釋放出來，并使蛋白質變性，使DNA與蛋白質分離。DNA和蛋白的分離蛋白質：常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）RNA：常選用RNase消化多糖：提取液中加1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)

。DNA純化（去雜質）1）-70℃冰箱劃出保存菌種，30℃LBM培養基培養過夜；2）選取分隔良好的單菌落，接種到200mlLB液體培養基中，30℃，震蕩培養過夜；3）4℃，4000rpm，10min回收菌體，用20ml0.85%NaCl，洗滌兩到三次；4）去除上清液，用TE緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，室溫反應30min；5）加入10%SDS，至終濃度1%，50℃，10min；6）加入20mg/ml的蛋白酶K，至終濃度100μg/ml，溫和顛倒離心管數次，37℃過夜反應或50℃3hr。7）加入5MNaCl到終濃度0.7M，充分混勻，然后加入1/10體積的CTAB/NaCl，混勻，65℃，20min；8）冷卻到室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，8000rpm,10min，4℃離心，回收水相；9）重復抽提溶液，直至沒有白色界面出現，上清加入1/10體積的3MNaAc（pH7.0），0.6倍體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻；10）用頂端封閉的L型毛細管勾出絲狀DNA沉淀，轉入70%乙醇中漂洗，晾干片刻，（不可完全干透，否則極其難溶解），于3-5ml的TE中輕輕攪動，使其脫落，4℃放置過夜，使完全溶解。RNase可在step6加入TotalDNAextraction限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。3.限制性內切酶第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。命名HindⅢ

屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶限制性核酸內切酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口質?；駾NA片段的酶切過程：

1、在0.5mLEp管中依次加入下列溶液于0.5ml離心管中

提取質粒DNA3.0L10×bufferH1.0lEcoRI2.0U

ddH2O5.8L

10L

2、輕輕混勻,置于37℃水浴中酶解1.5h。

保護堿基：PCR產物末端限制酶切位點的切斷情況各種內切酶在不同通用緩沖液中的活性雙酶切時通用緩沖液中的選擇和方法相鄰酶切位點的雙酶切效果相鄰酶切位點分步酶切時的效果雙酶切電泳檢測M.Marker;1PCRproduct;2.pET29a/KpnI&XhoI

3~4pET29a-nph/KpnI&XhoI;5.pET29a-nph;6.pET29aM..λDNA/HindⅢMarker;1.pUC19;2.pCFT23.pCFT2/EcoRⅠ;4.pCFT2/EcoRI&PstI4、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(密度與瓊脂糖濃度相關)；生理條件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基團呈離子化狀態，因此將核酸分子置于電場中時，它們會向正極遷移，由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構象。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構型，所以其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環DNA分子或線性DNA分子要快。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2緩沖液在電泳過程中的一個作用是維持合適的pH。電泳時正極與負極都會發生電解反應，正極發生的是氧化反應（4OH--4e->2H2O+O2)，負極發生的是還原反應（4H++4e->2H2)，長時間的電泳將使正極變酸，負極變堿。一個好的緩沖系統應有較強的緩沖能力，是溶液兩極的pH保持基本不變。電泳緩沖液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化。電泳緩沖液還有一個組分是EDTA，加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+

等離子，防止電泳時激活DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。

Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）常用電泳緩沖液TAE是使用最廣泛的緩沖系統。其特點是超螺旋在其中電泳時更符合實際相對分子質量，且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%。TAE的缺點是緩沖容量小，長時間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環裝置使兩極的緩沖液得到交換。TBE的特點是緩沖能力強，長時間電泳時可選用TBE，并且當用于電泳小于1kb的片段時分離效果更好。TBE用于瓊脂糖凝膠時易造成高電滲作用，并且因與瓊脂糖相互作用生成非共價結合的四羥基硼酸鹽復合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收電泳中使用。TPE的緩沖能力也較強，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用。電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內。②使樣品呈色，使加樣操作更方便。③形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。上樣緩沖液溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發下，發出紅色熒光。其熒光強度與DNA的含量成正比。據此可粗略估計樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng。核酸染色劑注意事項：EB是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環境。DNA分子量標準1.凝膠制備：制備0.8%瓊脂糖凝膠。稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100mL1×TAE緩沖液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴EB，小心混勻，倒到制膠槽上，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層，不要產生氣泡（厚度約為3～4mm）；室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子。制好膠后將凝膠連同內槽放在含有1×TAE緩沖液的電泳槽中使用(注意:電泳槽中的緩沖液應與配膠用的緩沖液成分、濃度一致)。2.加樣和電泳：用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品孔內加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳（切記靠近加樣孔的一端為負，

80～100V的電壓下電泳，一般情況下，電壓/電極間距離應小于5V/cm），當溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停止電泳。

3.觀察拍照操作步驟酶切產物進行制備型瓊脂糖電泳，電泳至條帶完全分開；在長波紫外燈下切下所需條帶，盡量切除多余的瓊脂糖，置入1.5mleppendorf離心管中；65℃溶解凝膠，冷卻到室溫，加入1ml吸附樹脂，上下顛倒混勻；將樹脂轉移到連有吸附柱的注射管上，插入推桿，慢慢將樹脂擠入吸附柱；分開注射管，拉出推桿，然后連接注射管和吸附柱，加入2ml80%異丙醇，插入推桿，慢慢推下，清洗吸附小柱；取出吸附柱，放到eppendorf離心管上，10000g，20s離心；將吸附柱轉移到新的離心管上，加入預熱到70℃左右的TE，放置1min；10000g，1min離心，將所需要的片段收集在離心管內，-20℃保存。（該方法也可以直接回收酶切片段，對于500bp到15kb之間的DNA有很好的回收和純化效果）5酶切片段回收（(切膠)-樹脂吸附-洗脫回收）一般建立如下反應體系：加入0.1μg載體DNA以及等摩爾量的外源DNA。加水至8.5μl，于45℃熱激5min，使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到0℃，加入1μlT4連接酶緩沖液和0.5μlT4連接酶，16℃，酶連4小時以上，再4℃酶連過夜。6酶連三細菌基因轉移的方式細菌的三種水平基因轉移形式接合轉導轉化接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導）轉導(transduction)：由噬菌體作為載體介導轉化(transformation)：游離DNA分子+感受態細胞（一）細菌的遺傳轉化（genetictransformation）定義：游離DNA分子(質粒和染色體DNA)被自然或人工感受態細胞攝取，并得到表達的基因轉移過程。1、轉化1928年，Griffith發現肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉化現象目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉化的能力進行轉化，需要二方面必要的條件：受體細胞處于感受態：最容易接受外源DNA的一種生理狀態。轉化因子：外源游離dsDNA分子

以革蘭氏陽性的肺炎雙球菌為材料，其轉化過程大體是：1、雙鏈DNA片段與感受態受體菌的細胞表面特定位點結合。2、在位點上的DNA發生酶促分解，形成平均分子量為（4~5)x106D的DNA片段。3、DNA雙鏈中的一條單鏈逐步降解，同時，另一條單鏈逐步進入細胞。4、轉化DNA單鏈與受體菌染色體組上的同源區段配對，接著受體染色體組的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA所交換和取代，于是形成了雜種DNA區段。5、受體菌染色體組進行復制，雜合區段分離成兩個，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。當細胞分裂后，此染色體分離形成了一個轉化子。轉化全過程轉化整合過程轉化過程的特點：a）對核酸酶敏感；c）轉化是否成功及轉化效率的高低主要取決于轉化（DNA）給體菌株和轉化受體菌株之間的親源關系；d）通常情況下質粒的自然轉化效率低b）不需要活的DNA供體細胞；人工轉化用CaCl2處理細胞，電穿孔等是常用的人工轉化手段。在自然轉化的基礎上發展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎技術。用多種不同的技術處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態”。（二）細菌的轉導（transduction）由噬菌體介導的細菌細胞間進行遺傳交換的一種方式：一個細胞的DNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中能將一個細菌宿主的部分染色體或質粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體稱為轉導噬菌體細菌轉導的二種類型：普遍性轉導局限性轉導1普遍性轉導（generalizedtransduction）噬菌體可以轉導給體細菌染色體的任何部分到受體細胞中的轉導過程普遍性轉導過程2局限性轉導（specializedtransduction）把供體菌的少數特定基因轉移到受體菌中的過程溫和噬菌體感染整合到細菌染色體的特定位點上宿主細胞發生溶源化溶源菌因誘導而發生裂解時，在前噬菌體二側的少數宿主基因因偶爾發生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因轉移到受體菌中的過程溫和噬菌體λ裂解時的不正常切割：包含gal或bio基因（幾率一般僅有10-6）3局限性轉導與普遍性轉導的主要區別：a）普遍性轉導是誤包；局限性轉導是誤切。b）局限性轉導顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因導入受體，故稱為局限性轉導。而普遍性轉導攜帶的宿主基因具有隨機性，包裝的可能全部是宿主菌的基因。(三)細菌的接合作用(conjugation)接合作用：通過細胞與細胞的直接接觸而產生的遺傳信息轉移和重組過程證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）2.機制接合作用是由一種被稱為F因子的質粒介導F因子的分子量通常為5×107Da

，上面有編碼細菌產生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進行的20多個基因。含有F因子的細胞：“雄性”菌株（F+），其細胞表面有性菌毛

不含F因子的細胞：“雌性”菌株（F-），細胞表面沒有性菌毛F因子的四種細胞形式a）F-菌株，不含F因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。1）F+×F-雜交雜交的結果：給體細胞和受體細胞均成為F+細胞F+菌株的F因子向F-細胞轉移，但含F因子的宿主細胞的染色體DNA一般不被轉移。Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發生接合轉移轉移過程，就可以把部分甚至全部細菌染色體傳遞給F-細胞并發生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr×F-雜交Hfr菌株仍然保持著F+細胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細胞進行接合。所不同的是，F因子的先導區(leadingregion)結合著染色體DNA向受體細胞轉移，F因子除先導區以外，其余絕大部分是處于轉移染色體的末端，由于轉移過程常被中斷，因此F因子不易轉入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞(或接合子)大多數仍然是F-。染色體上越靠近F因子的先導區的基因，進入的機會就越多，在F-中出現重組子的的時間就越早，頻率也高。F因子不易轉入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞（或稱接合子）大多數仍然是F-。感受態細胞的制備轉化雙親雜交三親雜交四、細菌基因重組的方法感受態細胞：所謂感受態是指受體細胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態，可以通過物理與化學方法誘導形成，也可以自然形成。用于轉化的受體菌細胞一般是限制-修飾系統（Restriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對導入的外源DNA的切割。

基本原理：細菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發生變化1感受態細胞的制備1、從新活化的E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養中，37℃振蕩培養至對數生長期(12h左右)；2、將該菌懸液以1:100～1:50轉接于100mlLB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔20～30min測一次OD600，至OD600為0.3～0.5時停止培養（細胞密度在5×107個/ml左右），并轉裝到1.5mL離心管中；3、培養物于冰上放置20min；4、0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細胞,冰浴20分鐘；（CaCl2純度至關重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號的產品均影響感受態的轉化效率

）5、0～4℃，

4000g離心10min，倒凈上清培養液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴20min；6、0