第三章動、植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶80年代以來，生物工程研究和開發(fā)的新領(lǐng)域。動物細(xì)胞通過離心分離技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、胰蛋白酶消化等獲得；培養(yǎng)方式有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)；獲得疫苗、激素、多肽、單抗等；植物細(xì)胞通過搗碎、酶解、愈傷組織誘導(dǎo)獲得；培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、液體層培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等；主產(chǎn)色素、藥物、香精、酶等。動、植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞附著在固體或半固體的表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需有血清。動物細(xì)胞對環(huán)境敏感，包括pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力都比微生物有更嚴(yán)的要求，一般須嚴(yán)格的監(jiān)測和控制。植物細(xì)胞對營養(yǎng)要求較動物細(xì)胞簡單。但由于植物細(xì)胞培養(yǎng)一般要求在高密度下才能得到一定濃度的培養(yǎng)產(chǎn)物，以及植物細(xì)胞生長較微生物要緩慢，長時間的培養(yǎng)對無菌要求及反應(yīng)器的設(shè)計也提出特殊的要求。動植物、微生物細(xì)胞的培養(yǎng)比較微生物動物細(xì)胞植物細(xì)胞

大小懸浮生長營養(yǎng)要求生長速率代謝調(diào)節(jié)環(huán)境敏感細(xì)胞分化剪切應(yīng)力敏感傳統(tǒng)變異，篩選技術(shù)細(xì)胞或產(chǎn)物濃度1-10可以簡單快，倍增時間0.5-5小時內(nèi)部不敏感無低廣泛使用較高10-100多數(shù)細(xì)胞需附著表面才能生長非常復(fù)雜慢，倍增時間15-100小時內(nèi)部、激素非常敏感有非常高不常使用低10-100可以，但易結(jié)團，無單個細(xì)胞較復(fù)雜慢，倍增時間24-74小時內(nèi)部、激素能忍受廣泛范圍有高有時使用低第一節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶從中得到最普遍而必不可少的藥物有17類；全世界用其制備天然芳香化合物的價值超過15億＄/年；美國用其生產(chǎn)藥物超過30億＄/年；我國使用的中草藥及其制備大部分來自植物。植物來源的物質(zhì)生產(chǎn)幾乎采用提取分離法，如從木瓜中提取木瓜蛋白酶；1902，Haberlandt提出分離植物單細(xì)胞培養(yǎng)成株的設(shè)想，至今已成為專門學(xué)科。通過植物細(xì)胞產(chǎn)酶的進(jìn)展：表3-1目前植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶概況:

酶

植物細(xì)胞（年份）

糖苷酶

β-半乳糖苷酶漆酶過氧化物酶

β-葡萄糖苷酶酸性轉(zhuǎn)化酶堿性轉(zhuǎn)化酶糖化酶木瓜蛋白酶苯丙氨酸氨裂合酶

胡蘿卜細(xì)胞（1981）紫苜宿細(xì)胞（1982）假挪威槭細(xì)胞（1983）甜菜細(xì)胞（1983）大豆細(xì)胞（1989）利馬豆細(xì)胞（1987）甜菜細(xì)胞（1988）甜菜細(xì)胞（1988）甜菜細(xì)胞（1988）木瓜細(xì)胞（1990）花生細(xì)胞（1986）大豆細(xì)胞（1989）表3-1植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶和動物細(xì)胞相似細(xì)胞壁(CellWall)細(xì)胞膜(Cellmembrane)細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)液泡(Vacuole)細(xì)胞核(Nucleus)葉綠體(Chloroplast)固體顆粒(Solidgranule)線粒體(Mitochondrion)覆蓋在細(xì)胞膜外，由纖維素構(gòu)成，雖然厚但可讓物質(zhì)自由穿過。功能：1.支持細(xì)胞，使它有固定形狀。2.保護(hù)細(xì)胞

植物細(xì)胞通常有較大的液泡許多植物細(xì)胞都含有葉綠體；內(nèi)有綠色的葉綠素，鈉負(fù)吸收光能，進(jìn)行光合行用如淀粉顆粒和不溶解的廢物植物細(xì)胞的構(gòu)造一、植物細(xì)胞的特性

表2-2微生物、植物、動物細(xì)胞的特性比較（P78）微生物細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞細(xì)胞大小（μm）1~1020~30010~100倍增時間（h）0.3~6>12>15營養(yǎng)要求簡單簡單復(fù)雜對剪切力大多數(shù)不敏感敏感敏感主要產(chǎn)物醇類，有機酸，氨基酸，抗生素，酶，核苷酸色素，香精，藥物，酶激素，疫苗，單克隆抗體，酶二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點例如,紫草寧(shikonin)生產(chǎn)，發(fā)酵細(xì)胞中的紫草寧比紫菜根(Lithospermumerythrorhizon)中高10倍，比產(chǎn)率達(dá)到種植紫草的830倍。紫草寧及其結(jié)構(gòu)（1）提高產(chǎn)率植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點（續(xù)）（2）縮短周期發(fā)酵周期10～30天，種植周期幾個月～幾年。（3）易于管理減低勞動強度；不受地理環(huán)境和氣候條件等影響。（4）提高產(chǎn)品質(zhì)量主要產(chǎn)物濃度高，易于分離純化，減少環(huán)境中各種有害物質(zhì)污染和侵蝕。（5）其它生物反應(yīng)器的設(shè)計工藝條件注意的問題。三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程外植體細(xì)胞獲取細(xì)胞培養(yǎng)分離純化產(chǎn)物go1、外植體的選擇與處理從植株取出，預(yù)處理后用于植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的片段或小塊；選擇無病蟲害，生長旺盛的植株；切成小塊，消毒，漂洗back2、植物細(xì)胞的獲取（１）直接分離法，有機械法、酶解法；（２）愈傷組織誘導(dǎo)法；（３）原生質(zhì)體再生法需要大量無機鹽，除P、S、K、Ca、Mg外，還需B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、I需要各種維生素和植物激素，如硫胺素、吡哆素、煙酸、肌醇、激動素等。Sixmajorgroupsofplanthormones:1,AUXINS茁長素;2,CYTOKININS細(xì)胞分裂素;3,GIBBERELLINS赤霉素;4,ABSCISICACID脫落酸;5,ETHYLENE乙烯;6,BRASSINOSTEROIDS苔云素一般為無機氮源。一般以蔗糖為碳源。（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（續(xù)）（三）溫度的控制室溫（25℃）、（四）pH值的控制微酸性（pH5～6）（五）溶解氧的調(diào)節(jié)控制代謝慢，耗氧少，對剪切力敏感，攪拌不宜強烈。（六）光照的控制（七）前體的添加提高次級代謝物的產(chǎn)量。（八）刺激劑(electior)的應(yīng)用強化次級代謝產(chǎn)物的生物合成。常用微生物細(xì)胞壁碎片和胞外酶。四、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)清除超氧化物陰離子自由基(O2—)的重要金屬酶類。它和過氧化氫酶、過氧化物酶一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的酶促反應(yīng)防御體系，從而維護(hù)生物體內(nèi)細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng)。衰老自由基學(xué)說認(rèn)為衰老源于機體正常代謝過程中產(chǎn)生過量的自由基對機體損害的結(jié)果。超氧化物歧化酶(SOD)作為能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的自由基清除劑，具有延緩衰老的作用。天瑞SOD蘋果

大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)ＳＯＤ１、大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)２、大蒜細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)３、ＳＯＤ的分離純化第二節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語;1907年Harrison

和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細(xì)胞的培養(yǎng);動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細(xì)技術(shù)。許多細(xì)胞株、細(xì)胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系（Gey，1952），可用來進(jìn)行一系列研究，更加促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展;20世紀(jì)50年代,Earle,病毒疫苗細(xì)胞培養(yǎng);1967,動物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)微載技術(shù);1975,雜交瘤技術(shù);動物細(xì)胞可產(chǎn)生較高價值的物質(zhì),特別是激素、疫苗，單克隆抗體和酶等動物功能蛋白。動物細(xì)胞的構(gòu)造細(xì)胞膜(Cellmembrane)細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)細(xì)胞核(Nucleus)液泡(Vacuole)固體顆粒

(Solidgranules)線粒體(Mitochondrion)一層薄膜，由脂類和蛋白質(zhì)構(gòu)成；功能：1.包裏細(xì)胞質(zhì)

2.控制物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞呈膠狀的混合物，含多種化學(xué)物如：蛋白質(zhì)和水；包圍著更小的細(xì)胞器如線粒體和液泡；是細(xì)胞內(nèi)所進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的媒介。內(nèi)含染色體。染色體攜帶遺傳訊息及控制細(xì)胞里所有活動。被一層薄膜包圍，內(nèi)含溶解的化學(xué)物質(zhì)和食物粒子等。在呼吸作用中協(xié)助釋放能量。一、動物細(xì)胞特性1,無細(xì)胞壁,脆弱;2,體積比微生物細(xì)胞大幾千倍,稍小于植物細(xì)胞;3,具有群體效應(yīng)、錨定依賴性、接觸抑制性、功能全能性；4，營養(yǎng)要求復(fù)雜。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點1，主產(chǎn)各種功能蛋白；2，生長緩慢；3，需加抗生素防污染；4，對剪切力敏感；5，具錨定依賴性，宜貼壁培養(yǎng)；部分用懸浮培養(yǎng)；6，培養(yǎng)基成分復(fù)雜；7，原代細(xì)胞培養(yǎng)50代后需重新分離細(xì)胞。三、動物細(xì)胞培養(yǎng)的方式來自血液、淋巴組織的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞等非錨定依賴性細(xì)胞采用。類似于微生物細(xì)胞的深層發(fā)酵，但工藝條件有較大差別。雜交瘤細(xì)胞半懸浮培養(yǎng)

1、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法的優(yōu)點可連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害。細(xì)胞收率高，并可連續(xù)測定細(xì)胞濃度，還有可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。

注意事項培養(yǎng)過程中，為確保細(xì)胞呈單顆粒均勻懸浮狀態(tài)，需采用攪拌或氣升式反應(yīng)器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5％CO2的無菌空氣，保持細(xì)胞懸浮態(tài)并維持培養(yǎng)液溶解氧。此外不同細(xì)胞懸浮條件亦異，為使細(xì)胞不致凝集、成團或沉淀，在配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續(xù)更換部分培養(yǎng)液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液時尚可不必連續(xù)通入含5％CO2空氣。

來自動物器官中的細(xì)胞，采用:（1）滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng):結(jié)構(gòu)簡單,重現(xiàn)性好;2、貼壁培養(yǎng)將動物細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法稱為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。由葡聚糖凝膠制成微球,動物細(xì)胞依附其上單層生長繁殖,懸浮于培養(yǎng)液中;特點:比表面積大,單位體積培養(yǎng)液細(xì)胞產(chǎn)率高;具有懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點.（2）微載體系統(tǒng):制備微載體的材料主要有：葡聚糖（DEAE—SephadexA50及A25）塑料明膠玻璃纖維素微載體培養(yǎng)優(yōu)點兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，且是均相培養(yǎng)。細(xì)胞所處環(huán)境均一，放大容易。培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動化，障低了污染發(fā)生的機會。3、固定化細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)謂之細(xì)胞固定化培養(yǎng)法。錨定與非錨定依賴性動物細(xì)胞均可;一般采取：吸附法（所用載體有陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒）；包埋法（將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中）固定化培養(yǎng)優(yōu)點細(xì)胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長；細(xì)胞損傷程度低；易于更換培養(yǎng)液；細(xì)胞和培養(yǎng)液易于分離；培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡化了產(chǎn)品分離純化操作。為什么大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)需要用二氧化碳培養(yǎng)箱？

一般細(xì)胞培養(yǎng)液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)是一種生理pH緩沖系統(tǒng)（它是人體血液中最重要的pH緩沖系統(tǒng)），大多數(shù)培養(yǎng)液用它來保持穩(wěn)定的pH。用粉末配制培養(yǎng)液時，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細(xì)胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。

為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時傳代？體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時候，它就會停止生長。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時，正常的細(xì)胞停止生長，但是轉(zhuǎn)化（即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的對接觸抑制不敏感的細(xì)胞會繼續(xù)生長。如果不及時傳代，這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會逐步取代正常的細(xì)胞。四、動物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制種質(zhì)細(xì)胞：體細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞；工藝過程：種質(zhì)細(xì)胞胰蛋白酶懸浮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝過程（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)基組成成分1、氨基酸：各種必需氨基酸，谷氨酰胺等，作為碳源和能源利用；2、維生素：血清中，B