超聲波輔助技術超聲波原理人耳的聽覺范圍大約在20~18000Hz，高于這個頻率范圍的聲音聽不見，稱為超聲。聲波通過在介質中壓縮、膨脹來實現傳播。超聲波是一種能量傳播方式超聲波的特點1.比通常的聲波頻率高很多，波長短很多。2.同光波相似，具有反射，折射，散射，聚焦等幾何光學定律。3.比普通聲波強大的多的功率。4.介質對超聲波的吸收比對聲波大的多，因此其傳播距離短的多。5.對介質可產生顯著的聲壓作用。超聲效應1.機械效應：由于超聲的傳播引起介質的壓縮和拉伸，造成介質的運動，由于頻率很高，故振動加速度很大，其運動加速度可達到重力加速度的數萬倍，形成強烈的機械運動效應，甚至可以斷裂粉碎物質。2.聲流效應當超聲波射入兩個具有不同聲阻的介質界面時，動量發生變化，產生輻射壓力，引起撕裂，可對生物組織造成損傷。3.熱效應超聲波頻率高，能量大，被介質吸收時能產生顯著的熱效應。4.空化效應

超聲傳播于液體介質中時，由于劇烈的膨脹和壓縮，導致液體內部的小氣泡，以及局部產生超過液體分子間作用力的小氣泡，在聲壓的作用下，氣泡不斷運動迅速長大，而后突然破裂閉合，破滅時周圍液體突然沖入氣泡產生高溫、高壓，同時產生激波。局部瞬時溫度可達200度以上，上千個大氣壓。

微小空間內的高溫高壓，機械剪切力，以及由于高溫高壓使周圍的液體超臨界化，因而使得溶解、傳質和反應速度大大加快。空化是超聲應用中最重要的一種效應，具有如下特點：

1.波長越大，空化越明顯

2.溫度高，易于空化

3.液體中含氣量高有助于空化

4.超聲波頻率增高，外界氣壓增大，黏度大，空化減弱超聲波的綜合效應可以充分打碎細胞，攪拌，促進分子運動，幫助目標分子充分與溶劑混合，加速擴散，乳化等，幫助萃取的進行。選擇合適的聲波參數，使萃取液達到最大空化狀態，有助于超聲提取的分離效果。超聲波具有如此殺傷力，為什么可以用于醫學檢測？超聲波的應用超聲萃取用于從動植物中提取藥物或其他成分獲得非常好的效果，可以實現很好的細胞破碎效果和萃取效率，尤其是在天然植物藥用成分的萃取生產方面很有優勢。超聲萃取具有以下優點：1.提取時間縮短，能耗低，提取效率高2.萃取溫度低，不會破壞具有熱不穩定、易水解或氧化特性的有效成分3.常壓操作，工藝簡易安全，設備投資低4.適用范圍廣，與溶劑和目標物質的性質沒有關系。超聲懸浮利用駐波在聲場中的輻射壓力與固體液體微粒或生物細胞的重力相平衡，而使其穩定懸浮在聲場中的技術。超聲凝聚當超聲通過有懸浮顆粒的流體介質時，會帶動懸浮顆粒一起振動，而大小不同的粒子的振動相位和振幅各不相同，從而使顆粒互相聚集從而凝聚。例如用于酒類，飲料，醬油等的澄清，常規靜置法需要4~10天，使用超聲法處理醬油只需1~2分鐘，對葡萄酒用超聲只需處理1~2h即可完全沉淀。超聲過濾超聲駐波過濾：1、節點分離2、促使凝聚。3、使不溶物質懸浮，從而給溶解成分留出通道。超聲蒸發超聲蒸發為熱敏性物料的蒸發濃縮提供了理想途徑。利用超聲的作用，使液體霧化，使液體的蒸發面積大大增加，揮發速度也大大增加，使物料在較短時間和較低溫度下快速除去水分。超聲干燥具有增加物料內部水分擴散，加快水分遷移，使物料產生自熱，降低水分粘性，產生氣泡，驅使水分從毛細管中排出。相比常規干燥方法，具有干燥速度快，溫度低，干燥程度高，對產品的破壞小等優點超聲乳化和破乳利用超聲能量和空化作用，可將水珠打散并均勻分布在油中，可以減少或不使用乳化劑，就能生成穩定的乳化油，形成的乳液平均尺寸小，濃度高，可以控制乳液的類型。而使用混合聲強超聲可使乳化液破乳，實現油，水，固體的分離。超聲降解由于超聲的造成的極高運動速度，產生激烈的機械振動，分子在介質中隨著波的高速振動及剪切力降解。超聲形成高溫高壓的微環境，引起自由基的增加，促進氧化還原反應的進行。用于水體的有機污染的處理等領域，具有簡單，快速，高效，無污染等優點

超聲脫附用于其他分離技術的吸附分離單元的輔助解吸。超聲結晶超聲可以代替常規晶種，加快結晶，提高結晶產品性能，有效改善晶體產品的后處理過程。超聲殺菌超聲波分離應用展望超聲波分離時間較短，過程效果增強，在分離提取方面具有很好的推廣應用價值，目前多數超聲分離技術仍僅限于實驗室規模，其主要原因是其工程放大的問題。微波輔助分離技術微波輔助分離技術微波是一種電磁波，以直線方式傳播，并具有反射、折射、衍射等光學特性。微波遇到金屬物質會被反射，但遇到非金屬物質則能穿透或被吸收。微波的電場頻率介于300MHz~300GHz之間。微波原理微波是一種電磁輻射，被輻射物質的極性分子在微波電磁場中可快速轉向并定向排列，產生的撕裂和相互摩擦將引起物質發熱，即將電能轉化為熱能，從而產生強烈的熱效應。因此，微波加熱過程實質上是介質分子獲得微波能并轉化為熱能的過程。微波的加熱方式的特點微波加熱的整體快速：微波萃取主要是利用微波強烈的熱效應，但微波加熱方式不同于傳統的加熱方式，是同時直接作用于內部和外部的介質分子，使整個物料被同時加熱，即為“體加熱”過程，從而可克服傳統的傳導式加熱方式所存在的溫度上升較慢的缺陷。微波加熱的選擇性：體系的極性越大，對微波的吸收越大，極性小溶劑吸收微波能力也較弱，所以加熱效應也相對較差，若樣品和溶劑均不吸收微波,則微波加熱過程無法進行。微波輔助萃取原理：在微波萃取過程中，微波能迅速轉化為熱能而使細胞內部的溫度快速上升。當細胞內部的壓力超過細胞的承受能力時，細胞就會破裂，有效成分即從胞內流出，并在較低的溫度下溶解于萃取介質，獲得被萃取組分。微波萃取的特點1.快速高效2.加熱均勻3.加熱具有選擇性4.不具有熱慣性，易于控制5.試劑用量少，節能，污染小微波萃取的選擇性利用吸收微波能力的差異可使原料物質的某些區域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被萃取物質從基體中分離出來，進入到介電常數較小、微波吸收能力相對較差的萃取劑中。從原理上說，傳統的溶劑提取法，如浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續回流提取法等，均可加入微波進行輔助提取，從而成為高效提取方法。微波萃取的局限性1.對于熱敏性物質，微波加熱可能使其變性或失活。

2.微波萃取要求材料具有一定的吸水性，否則細胞難以吸收足夠的微波能而將自身擊破，產物也就難以釋放出來。

3.微波萃取過程中細胞因受熱而破裂，一些不希望得到的組分也會溶解于溶劑中，從而使微波萃取的選擇性降低。

微波萃取的主要影響因素

1.破碎度：被提取物經過適當破碎，可以增大接觸面積,有利于萃取過程的進行。

2.分子極性：在微波場中，極性分子受微波的作用較強3.溶劑：在微波萃取中，一次提取所需的溶劑用量可減少30%～60%。溶劑用量較大反而不利于提取，因為微波在穿透溶劑的過程中會發生衰減，溶劑越多，使得到達基體物質的微波能越少，提取效果就越差。

提取物料中若含不穩定或揮發性成分，則宜選用對微波高度透明的溶劑如正己烷等作為提取介質。將材料浸沒于溶劑中，在微波場的作用下，材料中的揮發性成分因顯著自熱而急速氣化，沖破組織，從材料中逸出。此時，包圍于藥材周圍的溶劑因沒有自熱，可捕獲、冷卻并溶解逸出的揮發性成分。

用水作溶劑時，細胞內外同時加熱，破壁的效果不會太理想，且大部分微波被溶劑所消耗，此時可先用微波處理經浸潤后的干材料，然后再加水或有機溶劑來提取有效成分，這樣既可節省能源，又可簡化微波提取裝置。4.溫度與時間微波提取有可能導致體系的溫度過度上升，為減小高溫的影響，可將微波提取過程分次進行，即先進行一段時間的微波提取，然后將體系的溫度冷卻至室溫再進行第二次微波提取，從而可最大限度地降低被提取成分因受熱而發生破壞的危險。微波萃取的安全性問題1.微波輻射的防護2.有機溶劑的易燃性微波萃取制備系統1.封閉式2.敞開式3.連續流動式

1、封閉式（高壓式）

常用于一些猛烈條件下的萃取，反應溫度可高于100度。萃取時間短，萃取效率高，試劑消耗少需要注意安全問題，特別是在使用揮發性溶劑的情況下，必須有高能排風體系和壓力安全裝置，并在開啟容器前冷卻到室溫。

2敞開容器系統系統內有冷卻裝置，在大氣壓下工作相對更加安全，處理量更大。1.微波爐2.瓶架

3.蒸餾瓶4.攪拌器5.銅管6.冷凝管7.開關8.控制面板3.連續流動式

萃取溶劑連續流動而樣品隨之流動或固定不動的一種微波萃取體系，可以與檢測儀器相偶聯，進行實時監測。基因工程菌重組蛋白原核生物與真核生物基因表達有什么區別？用原核微生物表達真核基因會如何？蛋白包涵體什么是包涵體重組基因工程菌生產蛋白質，其表達形式可以是分泌表達、胞內可溶性表達、胞內不溶性表達。由外源基因在宿主細胞中表達的不溶性蛋白聚合體稱為包涵體。包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余還含有核糖體元件、RNA聚合酶、內毒素、外膜蛋白，質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。E.coli是常用的基因工程宿主菌，包涵體常見于大腸桿菌中，但其他菌種也可以形成包涵體。當重組蛋白以包涵體形式存在時，就需要對包涵體進行變性復性處理。對包涵體的變性復性是重組蛋白藥物生產中最關鍵的技術之一。包涵體的特點1.是由宿主菌表達的外源基因的蛋白產物。2.包涵體密度高、折光性強，形態容易觀察到。3.具有不溶性，可通過離心將其和其他可溶性蛋白分離4.不易受蛋白酶影響5.無生物活性6.具有普遍性，很多在E.coli中表達的真核基因產物都以包涵體形式存在。包涵體形成的機制

包涵體形成的根本原因是基因的高水平表達。即使是內源性蛋白，表達過量時也會形成包涵體。活性蛋白的合成包括，肽鏈的合成，蛋白的折疊，蛋白的聚集。如果新生肽鏈的速率超過蛋白正確折疊的速率，就會導致包涵體的形成。包涵體形成的機制

包涵體是由部分折疊的中間體之間的錯誤聚合而發生聚集形成的，即不是由完全舒展的肽鏈或成熟的蛋白質聚集成的。

UINU：解鏈態，I：折疊中間體，N：天然態蛋白聚集物主要作用是重組蛋白之間的疏水作用，二硫鍵的錯配也有影響。影響包涵體形成的因素1、表達量過高，在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合等。2、重組蛋白的氨基酸組成：一般含硫氨基酸越多越易形成包涵體，脯氨酸，天冬氨酸，甘氨酸的含量與包涵體的形成呈正相關。

3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。4、重組蛋白是異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，如分子伴侶蛋白(分子自組裝與蛋白折疊)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。包涵體的利與弊優點：1.具有高密度，不溶性，易于分離純化。2.抗蛋白酶消化，穩定不易被降解。3.包涵體無活性，對于生產對宿主菌有毒害作用的蛋白產品時十分有利。4.降低了胞內外源蛋白的濃度，有利于表達量的提高。

5.對機械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，與細胞膜碎片分離。缺點：1.包涵體需經過變性復性處理，過程中常常伴有蛋白的水解和沉淀，形成異構體，引起蛋白質的不可逆修飾及性質改變。導致蛋白產量降低2.要加入各種變性劑，復性試劑，表面活性劑等試劑，操作繁瑣，成本昂貴。包涵體的純化與復性目的與思路：1.使原本緊密聚集的蛋白包涵體分散開成蛋白單體。2.使分散開的蛋白單體重新正確折疊為具有生物活性的蛋白質。包涵體的純化與復性步驟：1.包涵體的提取基因工程菌發酵液，經離心濃縮后破壁，然后以5000-20000g15min離心，可使大多數包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。2.洗滌為了除去包涵體上粘附的雜質，如膜蛋白或核酸，應用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,如尿素和鹽酸胍，過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解，此外還可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。3.溶解變性劑：一般用強變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl6M），打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展，鹽酸胍是較尿素強的變性劑，能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導致多肽鏈的自由氨基甲酰化，特別是在堿性pH值下長期保溫時。去垢劑：如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。但是由于SDS較難徹底的去除而限制了其使用。極端pH：可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。

還原劑：如果蛋白間存在二硫鍵，在溶解時還應使用還原劑。還原劑一般是DTT，對于沒有二硫鍵的某些包涵體，有時還原劑的使用也是有用的，可能是由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。

4.純化包涵體溶解后進行純化有助于提高復性率，純化的方法主要有膜過濾，電泳，色譜等。5.重組蛋白質的復性使散開的蛋白肽鏈重新折疊成正確的高級結構，從而恢復其生理活性。通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的伸展狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵重新正常形成。變性蛋白過渡態蛋白天然態蛋白影響復性效率的因素蛋白質的復性濃度：正確折疊的蛋白質的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質的濃度是使蛋白質聚集的重要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。pH：復性緩沖液的pH值應在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復性效率，最適宜的復性pH值一般是8.0-