☆選修3☆現代生物科技專題DNA重組技術的基本工具

1.基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過__________和__________，賦予生物以__________的遺傳特性，創造出符合人們需要的新的生物類型和生物產品。基因工程是在__________上進行設計和施工的，又叫做__________。DNA重組技術

體外DNA重組轉基因技術新DNA分子水平操作環境操作對象操作水平基本過程結果生物體外基因ＤＮＡ分子水平剪切拼接導入表達人類需要的基因產物基因拼接技術或DNA重組技術實質：基因重組2.基因工程的基本工具(1)“分子手術刀”——__________①來源：主要是從__________中分離純化出來的。②功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種__________的核苷酸序列，并且使每一條鏈中__________部位的兩個核苷酸之間的__________斷開，因此具有__________性。③結果：經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式：__________和__________。專一

限制性核酸內切酶（限制酶）原核生物特定特定磷酸二酯鍵黏性末端平末端(2)“分子縫合針”——__________①兩種DNA連接酶（大腸桿菌DNA連接酶和T4-DNA連接酶）的比較：a.相同點：都縫合__________鍵。b.區別：大腸桿菌DNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的__________之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合_____________。②與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將__________加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接__________的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶

磷酸二酯黏性末端兩種末端單個核苷酸兩個DNA片段DNA連接酶注：DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶作用實質都是催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵是否需模板不需要需要連接DNA鏈雙鏈單鏈DNA連接酶DNA聚合酶作用過程在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羥基上，形成磷酸二酯鍵作用結果將存在的DNA片段連接成重組DNA分子合成新的DNA分子(3)“分子運輸車”——__________①運載體具備的條件a.能在受體細胞中復制并穩定保存。b.具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。c.具有標記基因，供重組DNA的鑒定。②最常用的運載體是__________,它是一種裸露的、結構簡單的、獨立于__________核區DNA之外，并具有__________的雙鏈__________DNA分子。③其他運載體：__________、__________。動植物病毒載體質粒細菌自我復制能力環狀噬菌體①解旋酶：該酶能在DNA復制或轉錄時破壞DNA堿基對間的氫鍵，從而將雙螺旋打開。②DNA水解酶：該酶能催化DNA水解。③RNA聚合酶：該酶能在轉錄時將單個的核糖核苷酸連接成RNA單鏈。區分以下幾種酶跟蹤訓練（2008年全國卷Ⅰ）已知某種限制性內切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如下圖中箭頭所指。如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段。現有多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經該酶酶切后，這些線性DNA分子最多能產生長度不同的DNA片段種類數是（）A.3B.4C.9D.12C1．(2009年浙江高考題)下列關于基因工程的敘述，錯誤的是(

)A．目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物B．限制性核酸內切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達【答案】

D下列有關基因工程技術的正確敘述是（）A．重組DNA技術所用的工具酶是限制酶、連接酶和運載體B．所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列C．選用細菌作為重組質粒的受體細胞是因為細菌繁殖快D．只要目的基因進入了受體細胞就能成功實現表達【答案】C基因工程的基本操作程序基礎梳理基因工程的基本操作程序包括：目的基因的獲取、基因表達運載體的構建、將目的基因導入受體細胞及目的基因的表達與檢測等四個步驟。1.目的基因的獲取(1)目的基因：__________。(2)原核基因采取__________獲得，真核基因通過__________獲得主要是編碼蛋白質的結構基因直接分離人工合成(1)直接分離：從自然界已有的物種中分離，如從基因文庫中獲取。(2)人工合成目的基因常用的方法有：①已知核苷酸序列的較小基因，直接利用DNA合成儀用化學方法合成，不需要模板。②以RNA為模板，在逆轉錄酶作用下人工合成。反轉錄法化學合成法(3)PCR技術擴增目的基因①原理：__________。②過程：變性，退火，延伸。第一步：加熱至90～95℃__________；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。2.基因表達運載體的構建(1)目的：使目的基因在受體細胞中__________，并且可以__________，使目的基因能夠__________。(2)組成：__________＋__________＋__________＋__________DNA解鏈

DNA復制標記基因

穩定存在遺傳至下一代表達和發揮作用目的基因啟動子終止子材料：Taq酶，引物，目的基因，脫氧核苷酸目的基因與運載體結合注意：要用相同的限制酶切割質粒和目的基因①啟動子：是一段有特殊結構的__________，位于基因的__________，是__________識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出__________，最終獲得所需的__________。②終止子：也是一段有特殊結構的__________，位于基因的__________。③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是_________

_。DNA片段首端RNA聚合酶mRNA蛋白質DNA片段尾端抗生素抗性基因抗青霉素基因，抗四環素基因等3.將目的基因導入受體細胞(1)轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。(2)常用的轉化方法將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是__________，其次還有__________和__________

等。將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是__________

。此方法的受體細胞多是__________。將目的基因導入微生物細胞：原核生物作為受體細胞的原因是_______________________

___，最常用的原核細胞是_____________________。其轉化方法是：先用__________處理細胞，使其成為__________，再將重組表達運載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態細胞混合，在一定的溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術受精卵繁殖快、多為單細胞，遺傳物質少大腸桿菌Ca2+感受態細胞生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法顯微注射技術Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程將目的基因插入到Ti質粒的T－DNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→重組表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子(3)重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達運載體的受體細胞的依據是__________是否表達。4.目的基因的檢測與鑒定分子水平的檢測：(1)首先要檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用______________。(2)其次還要檢測目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是采用_____________________________________。(3)最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行_________。個體水平的鑒定：有時還需進行______________的鑒定。如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。個體生物學水平標記基因DNA分子雜交技術用標記的目的基因作探針與mRNA雜交抗原－抗體雜交植物轉基因過程原生質體DNA分子雜交技術DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜探針必須經過標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素,但由于同位素的安全性，近年來發展了許多非同位素標記探針的方法。

歸納整合

一、外顯子與內含子一般來說，真核生物的結構基因都是由外顯子和內含子組成原核細胞的基因真核細胞的基因不同點編碼區連續；結構簡單編碼區有間隔，不連續；結構復雜相同點都有編碼區和非編碼區；編碼區都有調控遺傳信息表達的核苷酸序列；編碼區上游都有與RNA聚合酶結合的位點

二、原核細胞與真核細胞的基因結構的比較基因工程的應用

基礎梳理1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物的__________。2.動物基因工程：提高動物生長速度、改善畜產品品質、用轉基因動物生產__________。3.基因治療：_______________導入病人體內，使該基因表達產物發揮作用。把正常的外源基因品質藥物一、植物基因工程與動物基因工程的成果外源基因類型及舉例成果舉例抗蟲轉基因植物抗蟲基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因抗蟲水稻、抗蟲棉、抗蟲玉米抗病轉基因植物抗病毒基因：病毒外殼蛋白基因、病毒的復制酶基因抗真菌基因：幾丁質酶基因抗病毒煙草、抗病毒小麥、抗病毒番茄、抗病毒甜椒抗逆轉基因植物抗逆基因：滲透壓調節基因、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因抗鹽堿和抗干旱的煙草、抗寒番茄、抗除草劑的大豆和玉米外源基因類型及舉例成果舉例改良品質的轉基因植物優良性狀基因：提高必需氨基酸含量的蛋白質編碼基因、控制番茄成熟的基因、與花青素代謝有關的基因高賴氨酸玉米、耐儲存番茄、新花色矮牽牛提高生長速度的轉基因動物外源生長激素基因轉基因綿羊、轉基因鯉魚改善畜產品品質的轉基因動物腸乳糖酶基因乳汁中含乳糖較少的轉基因外源基因類型及舉例成果舉例生產藥物的轉基因動物藥用蛋白基因+乳腺蛋白基因的啟動子等調控組件轉基因動物具有乳腺生物反應器作器官轉移植供體的轉基因動物將外源的抗原決定基因表達的調節因子導入到器官供體基因組或除去供體的抗原決定基因無免疫排斥反應的轉基因豬二、基因診斷與基因治療1.基因診斷(1)原理：DNA分子雜交。(2)過程：制備用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標記的DNA（患者DNA）分子作探針；將待測DNA制成單鏈；讓兩者進行雜交，若兩者能進行互補配對，則說明患有此病，否則不患此病。2.基因治療(1)原理：把正常的外源基因導入有基因缺陷的細胞中，達到治療疾病的目的。病人細胞中既有缺陷基因，也有正常基因。（體內和體外）跟蹤訓練（2009年安徽卷）2008年諾貝爾化學獎授予了“發現和發展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉入真核生物細胞內，表達出的蛋白質就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是（）A.追蹤目的基因在細胞內的復制過程B.追蹤目的基因插入到染色體上的位置C.追蹤目的基因編碼的蛋白質在細胞內的分布D.追蹤目的基因編碼的蛋白質的空間結構C基礎梳理蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過__________或__________，對現有蛋白質進行__________，或制造一種__________，以滿足人類的生產和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產_______________的蛋白質）蛋白質工程的崛起自然界已存在

基因修飾基因合成改造新的蛋白質歸納整合一、蛋白質工程1.蛋白質工程的目的：生產符合人們生活需要的并非自然界已存在的蛋白質。2.蛋白質工程的基本原理蛋白質工程的目標是根據人們對蛋白質功能的特定要求，對蛋白質基本結構進行分子設計。由于基因決定蛋白質，因此，要對蛋白質結構進行設計改造，