細胞生物學細胞生物學研究方法湯薇陜西師范大學2013中學生物學骨干教師專業培訓

細胞形態結構的觀察方法

細胞組分的分析方法

細胞培養、細胞工程用于細胞生物學研究的模式生物細胞生物學研究方法

光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope）

細胞形態結構的觀察方法

離心分離技術

細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細胞內特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術

定量細胞化學分析技術細胞電泳細胞組分的分析方法細胞的培養

細胞工程

細胞培養、細胞工程技術

普通復式光學顯微鏡技術（

lightmicroscopy）

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserConfocalMicroscopy）

倒置顯微鏡（invertedmicroscope）相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）

光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)電子顯微鏡的基本知識電鏡的基本構造電鏡與光鏡的比較電子顯微鏡的主要類型掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

透射電鏡（Transmissionelectronmicroscope，TEM）

主要電鏡制樣技術

電子顯微鏡技術

分辨率是指區分開兩個質點間的最小距離普通復式光學顯微鏡技術1600倍是光學顯微鏡放大倍率的最高極限光學顯微鏡是一種以可見光為光源利用光學透鏡產生影像放大效應的顯微鏡。ABDCEFHGFas蛋白免疫組化染色（400倍）原理與應用

直接熒光標記技術

間接免疫熒光標記技術

用于特異蛋白質等生物大分子的

定性定位：綠色熒光蛋白(GFP)的應用

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）熒光顯微鏡是以紫外光為光源，用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。ABCFEHDGAnnexinV-FITC-PI染色（400倍）免疫熒光技術標記細胞骨架綠熒光水母——通過體內綠色熒光蛋白發光科學家在線形蟲體內植入綠色熒光蛋白質2008年的諾貝爾化學獎授予美籍日裔科學家下村修、美國科學家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學家錢永健三人，以表彰他們發現和發展了綠色熒光蛋白質技術。

激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態，也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。原理特點： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構樣品的三維結構。激光共聚焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）P53蛋白在細胞內位置變化串葉松香草作者：Shirley

Owens；城市：美國法拉盛；技術：激光掃描共聚焦。倒置顯微鏡InvertedMicroscope

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養的活細胞，具有相差物鏡。貼壁培養細胞觀察懸浮培養細胞觀察相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉換成振幅差，可用于觀察活細胞微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）偏振光經合成后，使樣品中厚度上的微小區別轉化成明暗區別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究

活細胞中較大的細胞器錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細胞中的顆粒及細胞器的運動電鏡與光鏡主要結構性能的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差主要由4部分組成電子束照明系統；成像系統；真空系統；記錄系統。

掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構。其工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變為光信號，再變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。目前掃描電鏡的分辨力為6～10nm。

/人類血細胞SEM照片掃描電鏡觀察的花粉粒JEM-1011透射電子顯微鏡

透射電鏡的總體工作原理是：由電子槍發射出來的電子束，在真空通道中沿著鏡體光軸穿越聚光鏡，通過聚光鏡將之會聚成一束尖細、明亮而又均勻的光斑，照射在樣品室內的樣品上；透過樣品后的電子束攜帶有樣品內部的結構信息，樣品內致密處透過的電子量少，稀疏處透過的電子量多；電子束進行綜合放大成像，將電子影像轉化為可見光影像以供使用者觀察。目前TEM的分辨力可達0.2nm

。高爾基體透射電鏡圖（偽彩色）

超薄切片技術用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負染色技術與金屬投影

染色背景，襯托出樣品的精細結構 冰凍蝕刻技術（技術示意圖）

冰凍斷裂與蝕刻復型：觀察膜斷裂面的蛋白質顆粒和膜表面結構。

快速冷凍深度蝕刻技術（quickfreezedeepetching）電鏡三維重構技術

電子顯微術、電子衍射與計算機圖象處理相結合而形成的具有重要應用前景的一門新技術。它與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結合，是當前結構生物學（StructuralBiology）研究生物大分子空間結構及其相互關系的主要實驗手段。主要電鏡制樣技術

掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）由Binnig等1981年發明，根據量子力學原理中的隧道效應而設計。當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，針尖與樣品之間產生隧道效應而有電子逸出，形成隧道電流。電流強度和針尖與樣品間的距離有函數關系，因樣品表面原子凹凸不平，使探針與物質表面間的距離不斷發生改變，從而引起電流不斷發生改變。將電流的這種改變圖像化即可顯示出原子水平的凹凸形態。掃描隧道顯微鏡的分辨率很高，橫向為0.1～0.2nm，縱向可達0.001nm。它的優點是三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察，而普通電鏡只能觀察制作好的固體標本。利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質等分子的原子布陣，和某些生物結構，如生物膜、細胞壁等的原子排列。

用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物

差速離心：分離密度不同的細胞組分差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。

密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離

用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，通過重力或離心力場的作用使細胞組分分層、分離。密度梯度離心常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。離心分離技術

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些

特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量。

方法：FeulgenStaining等

細胞內核酸、蛋白質、

酶、糖與脂類等的顯示方法

1.Schiff反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紅色。這種反應通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。

2.金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應過程中生成有色沉淀，借以辨認所檢查的物質或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。

3.偶氮偶聯法：酚類化合物與偶氮染料結合后可以形成耐曬染料。4.聯苯胺反應：過氧化物酶分解H202。產生新生氧，后者再將無色的聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。

5.普魯士藍反應：三價鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍。

6.

Formazane反應：顯示脫氫酶。

7.

吲哚酚反應

（Nadi反應）：顯示細胞色素氧化酶。

8.

脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。

9.

茚三酮反應：顯示蛋白質。

免疫熒光技術： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(Western-Blot)

免疫電鏡技術：免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術特異蛋白抗原的定位與定性根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。如果將抗體結合上標記物，再與組織中的抗原發生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。常用的標記物有熒光素和酶。熒光素標記的稱為免疫熒光法常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明等。酶標記的稱為酶標免疫法，常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。抗體與抗原的結合方法可分為直接法和間接法兩種，直接法是將帶有標記的抗體與抗原反應，顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級反應的基礎上，再用帶標記的次級抗體同初級抗體反應，從而使初級反應得到放大，顯示增強。免疫熒光技術標記細胞骨架蛋白質電泳和轉膜儀器電泳后凝膠經考馬斯亮藍染色轉膜后經X射線膠片曝光

光鏡水平的原位雜交技術

（同位素標記或熒光素標記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合）

核酸體外擴增技術

細胞內特異核酸的定位與定性核酸體外擴增技術1.非等溫擴增——PCRPCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。2.等溫擴增——LAMP環介導等溫擴增技術，與以往的核酸擴增方法相比具有如下優點：(1)操作簡單：不需要特殊的試劑及儀器。(2)快速高效：因為不需要預先的雙鏈DNA熱變性，多數情況在15-60min即可完成。(3)高特異性：由于設計4種特異性引物，引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高。(4)高靈敏度：比PCR高出數量級的差異。PCR后瓊脂糖凝膠電泳結果實時熒光定量PCR儀記錄結果原理及應用：將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導入生物體內，經過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記物的準確位置和數量利用同位素的放射自顯影，對細胞內生物大分子進行定性、定位與半定量研究；實現對細胞內生物大分子進行動態和追蹤研究。前體物摻入細胞（標記：持續標記和脈沖標記）

放射自顯影技術將顯微鏡技術與分光光度計結合起來的技術。它以物質分子的光吸收、熒光發射和光反射特性作為測定基礎，可用來分析生物樣品細微結構中的化學成分，同時進行定位、定性和定量。

細胞顯微分光光度術（Microspectrophotometry）利用細胞內某些物質對特異光譜的吸收，測定這些物質 （如核酸與蛋白質等）在細胞內的含量。

紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法

流式細胞術（FlowCytometry）主要應用：定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

定量細胞化學分析技術流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術，所用儀器稱為流式細胞儀（flowcytometer）。流式細胞儀通常以激光作為發光源，經過聚焦后垂直照射在樣品流（單個細胞的液滴）上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。根據采集到的信號把特定的細胞或細胞器從群體中分類收集。

流式細胞術結果表示方式：散點圖，直方圖，密度圖，三維圖，等高圖散點圖直方圖

細胞電泳

在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發生泳動，這種現象稱為細胞電泳（cellelectrophoresis）。引起細胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細胞或處于不同生理狀態的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同。在恒定的電場條件下，同種細胞的電泳速度相當穩定，因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的ξ電位。ξ電位常因細胞生理狀態和病理狀態而異，因此在診斷疾病上有一定價值。此外由于不同類型的細胞在電場中的泳動速度不同，細胞電泳尚可用來分離不同種類的細胞，例如可把淋巴樣細胞與造血細胞分開。單細胞凝膠電泳技術（彗星電泳）

動物細胞培養 類型：原代培養細胞（primaryculturecell）

從動物機體取出的進行培養的細胞群。

繼代\傳代培養細胞（sub-culturecell）

將細胞從一個培養瓶轉移到另外一個培養瓶。 細胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制細胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失

植物細胞培養

類型：原生質體培養（體細胞培養）

單倍體細胞培養（花藥培養）非細胞體系（cell-freesystem）來源于細胞，而不具有完整的細胞結構，但包含了進行正常生物學反應所需的物質組成的體系。

細胞的培養

動物細胞培養

細胞培養方式大致可分為兩種：一種是群體培養，將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養（clonalculture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（clone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養

植物細胞培養1．組織培養：誘發產生愈傷組織，如果條件適宜，可培養出再生植株。用于研究植物的生長發育、分化和遺傳變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。

2．懸浮細胞培養：在愈傷組織培養技術基礎上發展起來的一種培養技術。適合于進行產業化大規模細胞培養，制取植物代謝產物。

3．單倍體培養：通過花藥或花粉培養可獲得單倍體植株，經人為加倍后可得到完全純合的個體。4．原生質體培養：脫壁后的植物細胞稱為原生質體，與完整細胞一樣具有全能性，仍可產生細胞壁，經誘導分化成完整植株。核糖體體外組裝DNA雜交細胞融合（cellfusion）技術通過培養和誘導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cellfusion）或細胞雜交（cellhybridization）。單克隆抗體技術（monocloneantibody）顯微操作技術（micromanipulationtechnique）

在高倍復式顯微鏡下，利用顯微操作器（micromanipulator）進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞工程