組合靶基因傳感器芯片

及自動檢測儀負責人：府偉靈負責單位：西南醫院檢驗科將壓電傳感器技術與基因芯片技術相結合適合臨床基因檢測的組合靶基因傳感器陣列及其自動檢測儀一研究內容與目標21.應用疾病診斷基因突變檢測環境監測32.儀器特點價格低廉、便于攜帶使用方便、可實時監測無需標記、可長期保存檢驗靈敏度高可同時檢測多個標本或同一標本多個基因4微型壓電傳感器陣列芯片的研制壓電諧振陣列自動檢測系統基因傳感器芯片及封裝、進樣系統基因檢測儀及應用軟件特異性探針的設計和合成各種疾病標本的收集、保存與處理確定相應的檢測項目對比實驗二已完成的研究工作5一.雜交反應動力學等研究離子強度對雜交效應的影響溫度對雜交效應的影響探針濃度對雜交效應的影響靶序列濃度對雜交效應的影響堿基不匹配對雜交效應的影響不同結合位點對雜交效應的影響不同探針長度對雜交效應的影響靶序列長度對雜交效應的影響金、銀膜作傳感器電極時檢測對比掃描隧道顯微鏡觀察61.離子強度對雜交效應的影響頻率變化值隨離子強度增加而增加石英晶體的振蕩性能受溶液電解質濃度的影響緩沖液NaCl濃度以0.2M較為適宜72.溫度對雜交效應的影響隨溫度增加，雜交時間有縮短趨勢，雜交前后的頻率差值逐漸減小隨溫度增加，靶序列與探針之間的離解率常數明顯升高。83.探針濃度對雜交效應的影響雜交效率與探針的初始濃度有關。探針濃度增加，雜交所致頻率變化值增大，但濃度過高時(1.0、3.5uM)，頻率變化值反而有所下降。其原因可能主要與探針的空間排列結構和DNA分子間的靜電排斥有關。94.靶序列濃度對雜交效應的影響靶序列濃度增加（從0.005uM到3.5uM），雜交所致頻率差值逐漸增大，Δf與[target]0呈一飽和曲線關系。靶序列濃度為0.001uM、0.0001uM時，傳感器未能檢測出頻率變化，此為靈敏度受限所致。提高靈敏度有多種方法，但在實際應用中的可行性還需進一步探討。105.堿基不匹配對雜交效應的影響不匹配堿基數增加，靶序列與探針之間的結合率明顯降低，而其離解率明顯增高，表明堿基不匹配使DNA雙鏈之間結合力減弱，更易離解。實驗提示，應用壓電傳感器陣列技術可以判斷兩條互補鏈之間堿基不匹配情況，顯示其具有很好的特異性。116.不同結合位點對雜交效應的影響靶序列分別在其3’端、5’端、及中間段與20堿基的探針互補雜交時，頻率差值無明顯差異，而中間段雜交時間有所延長。127.不同探針長度對雜交效應的影響在壓電傳感器上應用較長的DNA分子進行雜交檢測時，頻率效應更大，能更清楚地反映雜交情況，使實驗誤差更小。138.靶序列長度對雜交效應的影響短鏈靶序列(20~108個堿基)堿基數與△ｆ呈線性關系，而長鏈靶序列(225、379、654bp)時△ｆ增大趨勢明顯減緩。149.金、銀膜作傳感器電極檢測對比檢測基因時的穩定性、反應時間、頻率變化幅度以及雜交動力學測定等方面均無顯著差異。1510.掃描隧道顯微鏡觀察針尖為電化學腐蝕的鎢絲，以恒電流方式進行圖像采集，在大氣壓和室溫條件下，在納米級水平直接觀察金屬膜表面形態學變化。16銀膜空白電極照片。掃描范圍2nm×2nm石英晶片上銀原子分布均勻，排列有序

1.0uM、20堿基的探針固定在銀膜上，6-巰基己醇封閉。掃描范圍40nm×40nmDNA探針分子分布均勻，密度較大。由于顯微鏡在膜垂直方向上掃描幅度僅4nm，視野內看不到巰基己醇分子。1.0uM、20堿基的探針與1.0uM、20堿基的靶序列雜交，銀膜。掃描范圍40nm×40nmDNA雙鏈分子分布均勻。與雜交前比較，視野內分子密度增加，分子增粗。17二.壓電諧振陣列自動檢測系統

頻率采集電路計算機傳感器陣列振蕩電路參比傳感器電磁屏蔽系統檢測系統連接示意圖181.電路系統通道選擇電路壓電諧振電路差頻電路自動增益電路溫度補償電路計數電路自動尋址電路計算機接口電路19

壓電傳感器振蕩電路圖202.

2×5型傳感器陣列AT切型基頻10MHz晶膜直徑4.0mm靈敏度0.1ng2×５型石英諧振傳感器陣列示意圖

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21傳感器陣列及檢測系統

223.軟件系統數據多道采集模塊數據分析模塊數據統計模塊結果報告模塊234.檢測儀包括系統組合、外型設計及配套部件等工作目前已初步成形。24四.檢測MRSA的應用研究準確而快速地檢測耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)，是有效控制其流行的關鍵，目前主張從耐藥基因型進行檢測診斷。應用壓電傳感器陣列，同時檢測作為MRS耐藥標志的mecA基因和金黃色葡萄球菌特有的femA基因，并與其它常用方法進行了對比，探討應用壓電傳感器陣列技術檢測MRSA的可行性。25統計分析顯示：頻率變化與靶DNA濃度顯著相關，呈指數函數關系，并有關系式：

mecA[C]＝0.0003×e0.0414△FfemA[C]＝0.0003×e0.0336△F26從本實驗可知，與其它檢測方法相比，應用壓電傳感器陣列檢測臨床基因樣品將有許多優勢：①可以進行液相雜交定量檢測②可以進行DNA實時檢測③可以對多種DNA樣品同時檢測④特異性強⑤無污染27五.相關專利國內專利組合靶基因自動檢測方法及采用該方法的檢測儀.公開號:CN1261667A組合靶基因自動檢測儀.申請號：99123576.2微型石英諧振陣列基因傳感器芯片.申請號：99123577.0國際專利組合靶基因自動檢測方法及采用該方法的檢測儀.申請號：PCT/CN99/001921628六.論文發表及學術交流

美國微生物學會第100屆年會PiezoeletricGenosensorBasedonPCRAmplicationandApplicationtoDetectionofHumanPapillomavirusOncogene.2000年世界華人臨床生化會議(香港)ApplicationofPiezoelectricGenosensorTechniquesforRapidDetectionofHumanPapillomavirus.美國圣地亞哥世界基因芯片大會Applicationofpieoelectricgenosenortechinquesforrapiddetectionofhumanpapillomavius29組合靶基因自動檢測儀快速檢測人乳頭瘤病毒.中華檢驗醫學雜志.2000;23(5):264-266應用壓電基因傳感器芯片檢測結核分枝桿菌DNA.中華醫院感染雜志.2000,10(6):418-420壓電基因傳感器芯片技術在快速快速檢測人乳頭瘤病毒中的應用.中國檢驗醫學與臨床，2000，1(1):23-24Multichannelpiezoimmunoassyfordetectionofbacteriaandvireuses.ChemicalJournalofChineseUniversityies.1999;20(Spl):487PiPiezoeletricGenosensorBasedonPCRAmplicationandApplicationtoDetectionofHumanPapillomavirusOncogene.ChemicalJournalofChineseUniversityies.1999;20(Spl):42030壓電基因傳感器的研究進展.國外醫學·臨床生物化學與檢驗學分冊。2001,(4)壓電基因傳感器的構建.第三軍醫大學學報.已接收探針濃度對