PCR原理及各類PCR儀PCR原理PCR全稱是PolymeraseChainReaction，即聚合酶鏈式反應，是一種用于體外擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，PCR的最大特點，是能將微量的DNA通過復制大幅增加。PCR技術發展歷程普通PCR（梯度）熒光定量PCR數字PCR普通PCR（梯度）簡單進行DNA復制擴增，然后可用電泳或者紫外分光光度計進行擴增產物的檢測。目的：大量獲得復制的DNA產物普通PCR儀（梯度PCR儀）其實就是一臺溫控儀！關鍵部件是溫控模塊！PCR反應圖解和要素要素1、模板DNA2、dNTP3、Taq酶4、引物5、精確的變化的溫度衡量普通PCR儀的參數

（以thermo的Arktik為例）樣品模塊規格：96×0.2ml、384×0.03ml、雙48孔×0.2ml溫度梯度范圍：1-30℃升降溫速率：>3℃/s溫度均一性：±0.4℃（95℃時）溫度精確性度：±0.3℃溫控范圍：4-99.9℃熱蓋溫控范圍：30-110℃可調用戶界面：反應曲線圖顯示尺寸重量電壓數據交換（USB接口）保質期PCR儀三種控溫方法的區別

（calculated、block、probe）

以bio-rad的PCT-200型PCR儀為例：

A）計算控制（calculated）

計算控制在運行大多數程序中是最好的溫度控制方法，具有較好

的溫度一致性、可靠性。用計算控制時，儀器通過對樣品的管子或玻

片熱傳導的速度和樣品體積進行模塊溫度估算（當運行程序時，這些

樣品信息都會顯示）。因為這種估算是根據已知容量和熱力學的規律，

所以溫度比模塊或探針控制更加精確。運行計算控制能縮短實驗時

間，簡短的程序操作能保護酶的活性并減少引物的損失。

B）模塊控制（block）

模塊控制與計算控制精度相比較低。在模塊控制下，樣品溫度通

常是在模塊后才到達設置的溫度。這段延遲時間主要是因為管子的類

型和樣品體積引起的。

C）探針控制（probe）

通常，探針控制可用于不同的環境中，但是它需要小心使用。探

針不能用于微型板和玻片。

市場上主要的品牌和產品AB：2720、9700、ProFlex、VeritiBio-Rad：MJMini、MyCycler、PTC200、PTC240、C1000、S1000Eppendorf：MastercyclerproS/pro/pro384熒光定量PCR熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，PCR反應過程中，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對起始模板進行定量分析的方法。目的：獲得初始模板DNA的濃度。熒光定量PCR儀的關鍵是溫控和熒光激發、檢測系統！如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。定量原理

確定初始模板的濃度初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環數越少Log濃度與循環數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環數就可計算出樣品中所含的模板量熒光定量PCR兩種GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA1、染料法SYBRGreen1染料只有和雙鏈DNA結合后才發熒光2、探針法衡量熒光定量PCR儀的參數（招標）

（以AB7500為例）1工作條件：220V電壓，10A電源。相對濕度<80%。熱功率<2600W

2技術規格2.1熱循環系統2.1.1 加熱冷卻方式:半導體2.1.2 升降溫速率:3.5℃/秒以上*2.1.3溫度范圍:4℃-99.9℃*2.1.4控溫精確度:±0.25℃2.2樣品系統2.2.1 樣品通量:單管、8聯管、96孔板，并無需適配器2.2.2 反應體積:10-100ul2.2.3 運行時間:<2小時2.2.4 機械設計:樣品無需移動2.2.5反應后保存:可降溫至4℃保存2.3熒光系統2.3.1 熒光染料：FAMTM/SYBRGreenI,VIC/JOETM,NEDTM/TAMRATM/Cy3,ROXTM/TexasRed,Cy52.3.2 熒光校正：軟件支持Rox熒光校正去除誤差2.4光學系統2.4.1 激發光源：鹵鎢燈，配備時間監測及自我診斷程序2.4.2 濾光系統：五色光源濾光片結合熒光濾光片（630nm-650nm，570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm）2.4.3 檢測系統：CCD攝像機一次成像2.4.4 檢測方式：實時動態檢測，動態顯示，可同時檢測5種熒光染料，必須有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm這五塊濾光片*2.4.5實驗要求：必須能同時檢測FAM、VIC、TAMRA、ROX四種熒光，能進行探針法定量，開展CNV研究2.5 檢測性能2.5.1檢測靈敏度：能檢測到≤10個拷貝數的模板，置信度99.7%2.5.2線性范圍：109以上2.5.3檢測分辨率：99.7%置信度下能有效分辨5000和10000模板拷貝數的差異2.6分析功能2.6.1定量量型：能進行絕對定量和相對定量,可同時對無限個數據同時進行分析，比對和作柱形圖2.6.3分析應用：可以進行熔解曲線分析、突變分析、等位基因分析等2.7軟件系統

2.7.1 定量PCR軟件：有絕對定量和相對定量軟件*2.7.2PrimerExpress軟件：有，含正版引物與探針設計軟件，可進行TaqmanMGB探針的設計及合成2.7.3 熒光校正軟件：有*2.7.4拷貝數分析軟件：有，含CopyCaller分析軟件2.7.5 獨立相對定量軟件：有，可同時對無限個數據同時進行分析*2.7.6SNP分析軟件：有，含AutoCaller分析軟件2.8試劑盒2.8.1 安裝試劑盒：有2.8.2 基本試劑盒：原廠家可提供完備的基本試劑盒供選擇2.8.3 SNP試劑盒：可提供原廠家500萬種SNP檢測試劑盒

2.8.4 轉基因檢測試劑盒：原廠家可提供國際標準的轉基因檢測試劑盒2.8.5 拷貝數試劑盒：可提供原廠家160萬種SNP檢測試劑盒并有配套分析模塊2.8.6 藥物代謝酶分型試劑盒：原廠家可提供藥物代謝酶SNP分型試劑盒2.8.7MicroRNA分析試劑盒：原廠家可提供包含有針對人、小鼠、大鼠、擬南芥、果蠅和線蟲的MicroRNA分析產品。2.8.8 基因表達試劑盒：可提供原廠家100萬種基因表達檢測試劑盒*2.9 試劑、耗材：開放式2.10 裝機指標：99.7%的置信度下分辨5000和10000模板拷貝數的差異3基本配置和附件3.1商用主流計算機及UPS3.2安裝試劑盒和純熒光校正板3.3RNASEP校驗板3.4SDS系統操作軟件3.5PrimerExpress3.0引物和探針設計軟件

4選件：無

5資格證明：有ISO9001質量認證，符合CE認證，有醫療器械注冊證

6技術服務

6.1安裝、調試：需要原生產廠家現場安裝調試6.2培訓：需要原生產廠家進行安裝培訓和售后培訓6.3技術資料：全套安裝、操作和維護使用說明書，軟件免費更新

7質量保修期7.1保修期：自驗收合格日起整機（包括配件）一年全保，終身維護

7.2保修點：國內至少三個保修點可提供部件更換，原廠專業維修

*8其他要求：近5年內浙江省定量PCR（須為96孔板標準型配置），用戶不少于100個，提供詳細清單。市場上主要的品牌和產品ABI：7000、7300、7500、7700、7900HT、StepOnePlus、StepOne、PRISMStepOne；2015年新發產品：7300Plus！！BIO-RAD：CFX96、iQ5、MyiQ、DNAEngineOpticon2、Chromo4、MiniOpticon；Stratagene：MX3000P、MX3005P；Roche：LightCycler

480、LightCycler2.0、LightCyclerNano；Eppendorf：Masercycler；數字PCR數字PCR即DigitalPCR（dPCR)，是一種核酸分子絕對定量技術。相較于熒光定量PCR，數字PCR可讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。應用：1、絕對定量2、稀有突變檢測（傳染病研究如HIV）3、轉基因檢測4、環境樣本檢測5、單細胞基因表達6、病毒載量鑒定數字