時間分辨熒光蛋白Time-ResolvedProteinFluorescence熒光蛋白的時間分辨測量time-resolvedmeasurementsofprotein

fluorescence越來越普遍原因：時域（TD）和頻域（FD）儀器越來越可靠研究的挑戰缺少簡單的脈沖光源從蛋白質隨時間變化的數據解釋該現象1、蛋白質的熒光的單光子激發需要波長在280至305納米的范圍內。2、蛋白質熒光激發脈沖激光二極管尚未公布。脈沖LED用于蛋白質的熒光激發剛剛宣布，但脈沖寬度超過1納秒。3、最近的研究所用的脈沖將Ti的三倍頻輸出：藍寶石激光或同步加速器輻射。缺乏的認識色氨酸本身的強度衰減多個色氨酸殘基存在于一個單一的蛋白質，并顯示在復雜的衰變動力學當中色氨酸本身在在中性pH溶液中顯示一個多指數或者非指數衰減1.INTENSITYDECAYSOFTRYPTOPHAN:

THEROTAMERMODEL色氨酸旋轉異構體模型的強度衰變用時間分辨在解釋蛋白質的衰變強度時的困難在于對色氨酸本身強度衰減缺乏了解在中性水溶液中的色氨酸的強度衰減是一種已知的雙指數衰減，時間近3.1和0.5ns色氨酸雙指數衰變占主導地位是由于旋轉異構體的存在芳香族氨基酸和相關化合物在20°C，pH值7時的強度衰減吲哚色氨酸NATA酪氨酸O-甲基酪氨酸在溶液中的色氨酸側鏈采用不同的構象，一個色氨酸溶液可以被視為一個的旋轉異構體的混合物，即所謂的旋轉異構體。在中性水溶液中，色氨酸兩性離子形式時氨基被質子化（NH3+）和羧基電離（CO2–）。在溶液中的色氨酸能自淬滅，涉及吲哚環和帶正電荷的銨基團。色氨酸也可以由氨基酸側鏈淬火銨基淬火依賴于一定PH下色氨酸熒光量子產率隨著pH從8提高到10的氨基發生解離，量子產量和平均壽命增加約三倍如何通過氨基淬火解釋

色氨酸在pH值為7的雙指數衰減？旋轉異構體在淬火過程顯示了比0.5納秒短的衰減時間旋轉異構體的存在可能是在中性pH值色氨酸的多指數衰減的主要的原因酪氨酸和色氨酸及其中性的結構類似物2.TIME-RESOLVEDINTENSITYDECAYSOF

TRYPTOPHANANDTYROSINE

色氨酸和酪氨酸的時間分辨強度衰變

過去不能夠可靠地解決其衰減時間和幅度現在已知的0.5-和3.1-ns衰減組件顯示不同的發射光譜2.1色氨酸的衰變相關的發射光譜假設一個樣本顯示多指數衰減，其衰減在不同的發射波長不同。然后描述的強度衰減中αi（λ）是與波長相關的指數前因素和τi的衰減時間。這個表達式假設衰減時間與波長無關。發射光譜由于每個組件可以計算的短期和長期ns色氨酸的衰減成分的光譜分辨率

2.2酪氨酸及其中性衍生物的強度衰變酪氨酸也可以顯示復雜的衰變動力學，但其性質與色氨酸是相反的。酪氨酸及其中性類似物

N-乙酰基-L-酪氨酰胺的頻域的強度衰減酪氨酸本身顯示一個單指數衰變而NATyrA顯示一個雙指數衰變（可能是基態旋轉異構體的存在）酪氨酸在水中的強度衰減通常是一個單一的指數3.INTENSITYANDANISOTROPYDECAYSOFPROTEINS

蛋白的強度和各向異性衰變由于NATA顯示一個衰減時間，我們可以預期單色氨酸的蛋白質，顯示單指數衰減。但是大多數單-色氨酸的蛋白質顯示雙重或三重指數衰減3.1單指數強度和核糖核酸酶T1的各向異性衰減最單一的色氨酸蛋白顯示多指數衰減。然而，有有兩個已知的例外天青蛋白、核糖核酸酶T1米曲霉。大多數的核糖核酸酶不包含色氨酸。核糖核酸酶T1，它包含一個不尋常的單一的色氨酸殘基，一些條件下表現一個單指數衰減核糖核酸酶T1由

104個氨基酸組成的單鏈多肽

在2’-存在的核糖核酸酶T1結構GMP（2′-GMP刪除）。59色氨酸位于α-螺旋和表之間的結構。核糖核酸酶T1有四個苯丙氨酸，九個酪氨酸，和一個單一的—色氨酸殘基在位置59。色氨酸殘基的活性位點附近。時間分辨熒光強度和各向異性

在緩沖水溶液的pH值5.5的核糖核酸酶T1衰減該衰變成為在pH7雙指數。單指數衰變是方便的，因為變化的蛋白質結構可以被預期會導致更復雜的衰減動力學。檢測出單指數衰變成為多指數衰減比檢測在一個多指數衰減的變化簡單一些3.2膜聯蛋白V：鈣離子敏感的單色氨酸蛋白質對于大多數的蛋白質，甚至與單色氨酸殘基，強度和各向異性衰減更為復雜。一個例子是膜聯蛋白V，它具有一個單一的色氨酸殘基膜聯蛋白是一類同源蛋白以鈣依賴性方式結合到細胞膜上。在不存在鈣時膜聯蛋白V呈高度非指數的強度衰減鈣會導致強度衰減變得更像一個單一的指數。表明了附近的淬滅基團在無鈣的形式存在晶體膜聯蛋白Ⅴ的結構是與該現象一致，因為在鈣的存在下色氨酸殘基移離蛋白質3.3有兩個色氨酸蛋白質的各向異性衰減在多色氨酸殘基的蛋白中，每個殘基可以是剛性的或移動的。在相同的蛋白質色氨酸殘基在不同的位置可以有不同的運動和各向異性衰變。時間分辨的單色氨酸的各向異性衰變的磷轉運蛋白突變體。296nm激發4.ANISOTROPYDECAYSOFPROTEINS

蛋白的各向異性衰變前面我們看到的與蛋白質的研究基于色氨酸殘基的數量有限色氨酸殘基的數目增加時，它變得不切實際解決個別殘基在這樣的情況下，必須翔實的研究野生型蛋白質的壽命分布相移和解調的頻率依賴性在學葉菌的β-葡萄糖苷酶的熒光發射因素

中性pH在5，45和85℃。在所指示的溫度S.葉菌β-色氨糖苷酶壽命分布衰變是高度異質性，解釋雙峰壽命分布方面，隨著溫度的增加，這兩個組逐步向更短的壽命遷移5.TIME-DEPENDENTSPECTRAL

RELAXATIONOFTRYPTOPHAN

色氨酸的光譜松弛時間在這一分析，我們假設每個色氨酸殘基在所有的波長顯示相同的壽命。然而，一個單一的色氨酸殘基的壽命可能不是在所有的發射波長相同。吲哚甘油20°C的強度衰減不同的波長的發射光譜進行測量強度衰減強度衰減在310nm處，藍色波長比在390納米衰減得更迅速強度衰減在380nm處顯示的上升時間是一個激發態過程的證明衰變相關光譜（頂部）和時間分辨發射譜（下）。DAS和TRES是從吲哚的甘油在20℃下相同時間分辨衰變計算出來衰變相關的光譜和時間分辨發射

從譜圖，在30℃，289-nm激發髓鞘堿性蛋白6.PERSPECTIVESONPROTEINFLUORESCENCE

透視熒光蛋白大量的蛋白結構的可用性允許的蛋白質和它們的光譜特性的結構特征的相關性研究。如其中側鏈是最有可能以猝滅色氨酸。能量轉移從短到長波長色氨酸已經看到了幾種蛋白質。發射最大值可以是與曝光相關溶劑，從蛋白質看去結構。熒光蛋白的更加深刻的理解將允許它的使用來回答更具體的問題關于蛋白質功能和蛋白質的相互作用與其他生物分子。多光子激發顯微鏡MultiphotonExcitationandMicroscopy多光子激發特點激發波長：兩個或多個光子同時激發,激發波長是單光子激發波長的兩倍或多倍多光子激發：依賴于多個光子同時到達的時間：使用脈沖飛秒激光器(i.e.10-16seconds),且能提供更高的峰值功率；熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產生多光子吸收。熒光強度正比于激光強度多光子激發---一個非線性過程多光子與單光子比較

單光子

雙光子*照明錐體大體積激發

*激發局限在焦點