工業微生物誘變育種第一頁，共五十九頁，2022年，8月28日工業微生物育種過程分為三個階段:1、菌種基因型改變；2、篩選菌種，確認并分離出具有目的基因型或表型的變異株；3、產量評估，全面考察此變異株在工業化生產上的接受性。第二頁，共五十九頁，2022年，8月28日目的：1、提高有效產物的產量2、改善菌種特性、提高產品質量3、簡化工藝條件4、開發新品種第三頁，共五十九頁，2022年，8月28日

第一節誘變育種的試驗設計和準備工作

變異對微生物本身來說使其代謝向著異常方向發展，必然引起菌體基本代謝失調，此時菌體雖然具有生活能力，但細胞的某些功能卻顯著地降低了。高產突變型是一種數量性狀的遺傳變異，是由多基因決定的。結構基因、調節基因、滲透基因、輔助基因等，這些基因不可能通過一次誘變全部引起突變。第四頁，共五十九頁，2022年，8月28日

誘變育種工作包括誘發突變、突變株的篩選和高產突變株最佳環境條件的調整。

誘發突變包括出發菌株、誘變劑及其劑量的選擇、影響誘變效果的因素。

突變株的篩選包括篩選培養基和培養條件及選擇一個簡便、快速、有效的篩選方法。

環境條件調整是突變株的最佳培養條件改變。

第五頁，共五十九頁，2022年，8月28日

具體要選育怎樣的菌種，在誘變育種前，應該對大生產的設備和工藝具有相當的知識和全面的了解。

誘變育種工作量大，周期長，對一般周期為7-10d的抗生素菌種來說，一代誘變需2-3個月。第六頁，共五十九頁，2022年，8月28日一、誘變前對出發菌株的了解1、區分不同菌落類型一般情況下在同一種培養基和培養條件下往往會出現多種形態類型的菌落（約有2～5種），不同類型的菌落其代謝產物的生產能力有較大的差異。2、出現不同菌落的原因遺傳因素決定；常因為培養基組成或培養條件等的改變，引起菌落形態的變化。第七頁，共五十九頁，2022年，8月28日

二、全面了解菌種特性及其與生產性能的關系1、考查菌種的生活史，了解它們的形態、生理，生化等生物學特性，以及這些特性與代謝產物合成的關系。2、菌種的某些生物學特性與產量合成的相關性。第八頁，共五十九頁，2022年，8月28日

三、了解影響菌種生長發育的主要因素1、培養基2、培養基斜面制備技術3、移種的密度4、溫度5、濕度6、藥品和原材料質量第九頁，共五十九頁，2022年，8月28日四、了解菌種有效產物中的各種組分在代謝合成過程中與培養條件的關系。五、建立一個準確、簡便、快速檢測產物的方法六、研究最佳的菌種保藏培養基和培養條件第十頁，共五十九頁，2022年，8月28日第二節誘變育種的步驟與方法誘變育種的步驟和方法包括：出發菌株的選擇；單孢子（或單細胞）菌懸液的制備；誘變劑及誘變劑量的選擇；誘變的處理方法；以及菌種的純化分離等。第十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日一、出發菌株1、對一般出發菌株的要求2、選擇具有一定生產能力或某種特牲的菌株作為出發菌株3、選擇純種作出發菌株誘變中要選用單倍體、單核或少核的細胞為出發菌株。第十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日4、選擇出發菌株應考慮其穩定性5、連續誘變育種如何選擇出發菌株

“增變菌株”

-缺乏DNA修復機制6、選擇出發菌株的其他因素7、采用多出發菌株8、菌種代謝特點第十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日

二、出發菌株的純化純種分離方法:常用劃線分離法和稀釋分離法。顯微鏡操縱器分離單孢子

第十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日三、單孢子（或單細胞）懸液的制備1、供試菌株的孢子或菌株要年輕、健壯。對數期霉菌孢子濃度約為106/ml，放線菌孢子約為106～107/ml。菌懸液的孢子或細菌數可用平皿計數，血球計數器計數或光密度法測定。制備菌懸液通常采用生理鹽水。如果用化學誘變劑處理時，應采用相應的緩沖液配制。第十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日2、菌懸液的制備方法

細菌：最好在誘變處理前進行振蕩預培養，這不僅使菌體分散，得到單個細胞，還可利用溫度和碳源控制其同步生長，取得年輕的、生理活性一致的細胞；

第十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日孢子：在試驗中應盡量采用成熟而新鮮的孢子，并且置于液體培養基中振蕩培養到孢子剛剛萌發，即芽長相當孢子直徑的0.5～1倍、離心洗滌，加入生理鹽水或緩沖液制成孢子懸液，用血球計數法進行計數，調整菌體濃度。第十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日不產孢子的菌絲體進行誘變處理,有三種方法:第一、菌絲尖端法；第二、處理單菌落周圍尖端菌絲；第三、混合處理法。第十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日

3、制備原主質體作為誘變材料（1）在絲狀真菌中（2）細胞具有細胞壁（3）不產生孢子絲狀菌第十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日四、誘變劑及誘變劑量（一）誘變劑種類的選擇實踐證明并非所有的誘變劑對某個出發菌株都是有效的。一種誘變劑對A菌株有較高的誘變效應；對B菌株則可能相反。不同微生物對同一種誘變劑敏感性有很大區別。第二十頁，共五十九頁，2022年，8月28日1、選擇誘變劑選擇誘變劑時要注意選擇專一性比較強的誘變劑。2．根據菌種特性和遺傳穩定性選擇誘變劑3．參考出發菌株原有的誘變系選擇誘變劑第二十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日（二）最適誘變劑量的選擇

由于各種微生物間遺傳特性的差異，不同微生物或同一種微生物的各個菌種對同一種誘變劑的最適劑量是有區別的。在實際育種工作中，具體到某個菌種對某種誘變劑最適劑量的確定，作突變劑量曲線是比較可靠的。在判斷誘變劑量時，采用抗藥性突變是比較可靠的。劑量的大小常以致死率和變異率來確定。

第二十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日五、誘變劑的處理方式可分為單因子處理和復合因子處理。第二十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日

單因子處理，是采用單一誘變劑處理，一般認為單因子不如復合因子處理效果好，這己經被很多事實所證實。但當一種誘變劑對某個菌株確實是有效的誘變因子，那么單因子處理同樣能夠引起基因突變，效果也不錯．單一誘變劑處理，還可以減少菌種遺傳背景復雜化、菌落類型分化過多的弊病，使篩選工作趨向簡單化。當然單因子處理，一般情況突變率比復合因子要低，而且突變類型也比較少。第二十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日復合因子處理是指兩種以上誘變因子共同誘發菌體突變。又可以分為以下處理方式：1、兩種以上因子同時處理2、不同誘變劑交替處理通常以化學因子和物理因子交替進行效果較好。第二十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日3、同一種誘變劑連續重復使用經過一種誘變劑處理后的菌懸液，培養數小時之后（細菌或酵母），使細胞分裂1-2代，接著再處理，有時還可反復多次，最后進行分離篩選。誘發能力強的、對基因作用較為廣譜的誘變劑可連續重復使用，有益于變異乎的提高。但是單因子連續使用代數不能過多，否則也會出現“鈍化”現象。第二十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日4、紫外線光復活交替處理經紫外線照射后的菌體或菌懸液，暴露在日光中一定時間，接著用劑量更大的紫外線繼續照射，然后再讓其光照復活，經多次紫外線照射和光照復活交替，可以增加變異率，提高變異幅度。第二十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日5、誘變劑處理時間與誘變效應的關系

在頭孢菌素C產生菌選育中用甲基磺酸乙酯低濃度、長時間處理與高濃度、短時間處理的誘變效應是不同的，在致死率大致相同的情況下，前者比后者不僅正突變率高，而且提高的幅度也大。第二十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日處理具體方法1、直接處理方式，將菌懸液用物理、化學因子處理，然后分離，直接處理是最常用的方式。2、生長過程處理，適用于誘變作用強的而殺菌率較低的誘變劑，或在分裂過程中只對DNA起作用的誘變劑，如NTG、秋本仙堿等。第二十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日六、影響突變體的因素（一）菌種遺傳特性不同（二）菌體細胞壁結構絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質會阻礙誘變劑滲人細胞，減弱與DNA的作用。一般加大誘變劑量，效果會好一些。有的微生物細胞壁含有蠟質，常用一定濃度的洗衣粉、脂肪酶處理，除去蠟質，提高誘變效果。（三）環境條件的影響第三十頁，共五十九頁，2022年，8月28日1、誘變前預培養和誘變后培養出發菌株不管在誘變前或誘變后進行培養時，營養豐富的培養基中出現突變株的數量總是比營養貧乏的培養基中多。

后培養是指誘變后的菌懸液不直接分離于平板，而是立即轉移到營養豐富的培養基中培養數代。

誘變處理后保存于冰箱中的菌體懸液成分會影響突變體的成活率，應加一些使正突變個體和總菌數的死亡率減低的物質，如酪素水解蛋白、色氨酸等。第三十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日2、溫度、pH值、氧氣等外界條件對誘變效應的影響3、平皿密度效應第三十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日

第三節突變株的分離與篩選

對抗性突變株或營養缺陷突變株，常常用選擇性培養基進行篩選。

對產量突變來說，由于高產菌株和負變菌菌株都能在同一個培養基上生長，難以采用選擇性培養法進行篩選。

第三十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日

篩選突變株，首先根據篩選目的進行。由于微生物正突變概率極小，僅0.05％～0.2%，產量提高10％以上突變株也只有1/300，所以挑選的菌落愈多，概率就愈高。第三十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日投產率多數不宜投產少數適宜投產大多死亡少數存活存活率多數未變少數突變突變率多數負變少數正變正變率多數幅度小少數幅度大高產率出發菌株誘變一、誘變育種的基本環節第三十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日二、篩選的程序1、常規篩選程序這是傳統選育中常用的方注，挑選的菌落直接接入搖瓶培養，產物用常規法測定。

2、簡便法篩選程序在常規篩選法甚礎上進一步改進：一方面分離在平皿上的菌落采用瓊脂塊法，每代誘變處理后打1000—3000塊瓊脂菌落，甚至更多、另一方面，初篩搖瓶發酵液中產物分析，采用簡便、快速的瓊脂平板測定祛或其他簡便方法。

第三十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日設計或采用高效篩選方案或方法一個出發菌株誘變劑處理選出200個單孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株復篩（每株4瓶）選出5株第一輪第二輪五個出發菌株初篩（每株1瓶）選出50株復篩（每株4瓶）選出5株40株40株40株40株40株誘變劑處理第三十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日三、分離和篩選

多級水平篩選中經過平板篩選。留取5-10%，約挑選200株；第二階段是搖瓶初篩，選取25％-30％，第三階段搖瓶復篩，選出1-3株高產變株。有條件再進行小型發酵罐試驗。第三十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日（一）隨機篩選也稱搖瓶篩選。主要是隨機挑選的平皿菌落進行搖瓶篩選。初篩挑選菌落起碼要200個。（二）平板菌落預篩1、根據形態篩選變株2、根據平皿生化反應篩選突變株透明圈、顯色圈、抑制圈及混濁圈等生化反應來篩選。3、采用冷敏感菌篩選抗生素突變株4、濃度梯度法5、應用復印技術快速篩選突變體6、瓊脂塊法篩選變株第三十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日

四、搖瓶液體培養

常規隨機篩選的全過程，都要通過搖瓶培養，而平板菌落篩選是經過平板菌落預篩后，棄去大量低產菌株，被挑選的菌落移入試管斜面，然后再迸行搖瓶液體培養；才艷逐步地篩選出高產菌株。第四十頁，共五十九頁，2022年，8月28日五、產物活性測定1、瓊脂平板活性圈法2、濾紙片法3、瓊脂薄層紙片法篩選菌種為一種重復性和計量性的工作，所以必須應用統什方法。區別并肯定其產量上的差異。以便迸行下輪育種的評估。第四十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日

六、搖瓶數據的調整和有觀菌株特性的觀察分析

對搖瓶發酵液的測試數據要盡量應用生物學統計方法來處理，以便從復雜的差異中，去偽存直，由比及彼，抓住本質，找出其中真正的規律性。第四十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日七、培養基和培養條件的調整

培養基和培養條件的調整，常采用正交法和二次旋轉均勻設計。第四十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日八、變種的特性研究與鑒定

要研究菌種的純度、遺傳穩定性、菌落類型、群體的形態、生活能力、產孢子多少，保藏培養基及保藏方法、菌種碳、氮源利用情況、菌絲生長速度、菌絲量、發酵液粘度、過濾難易狀況；注意考察菌種抗生素的組分變化，色素等質量問題；研究最適移種期、移種量、通氣攪拌、溫度、pH等。優良菌株選育后，還應該從分子水平進一步對變株的生理生化特性加以鑒定以全面了解菌株各種屬性．這是考核菌株突變的重要指標，也是為菌株迸一步的研究和應用提供有指導意義的參考數據。第四十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日九、誘變育種實例（一）堿性脂肪酶高產變株FS1884的選育1．原生質體作為誘變材料2．采用定向控制的理性篩選—抗阻遏和解除反饋抑制篩選模型3．初篩來用大通量的瓊脂塊法4．結合飾變育種第四十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日1．原生質體作為誘變材料制備原生質體，用0.6％纖維素酶+0.6%蝸牛酶處理3h，0.6％NaCI＋0.3%CaCl2作穩定劑，可獲得原生質體。采用麩皮＋瓊脂粉作為再生培養基。將菌體制備成原生質體后，用UV、和He-Ne，激光進行誘變。經篩選發現，原生質體對誘變劑的敏感性要比孢子大得多。第四十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日

2．采用定向控制的理性篩選—抗阻遏和解除反饋抑制篩選模型脂肪酶和其他水解酶類同樣受終點產物或分解代謝產物阻遏的調節，琥珀酸鈉是脂肪酶的產物類似物，是該酶合成的阻遏物結構類似物，因此．可以用琥珀酸鈉來篩選抗阻遏突變株。篩選高滲透性菌株以解除胞內產物反饋抑制作用，達到提高酶產量的目的。制霉菌素能抑制真菌細胞膜麥角固醇的合成，引起胞膜透性的改變，可以用它師選高滲透型突變株。將琥珀酸鈉和制霉菌素分別以一定濃度加人到分離平板、有抗性的菌落陸續長出，這樣大幅度的濃縮了所需要篩選的菌株，加速育種的進度,從75U/ml逐步提高到7800U/m。第四十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日3．初篩來用大通量的瓊脂塊法

把瓊脂塊的菌落培養到產酶高峰期，然后移至油脂乳化液作為底物的鑒定平板上；在一定溫度下培育后，根據透明圈出觀快慢、大小及清晰度來決定取舍。每代誘變后可挑取菌落l000一3000株，在初篩階段可淘汰約95%低產菌株，這樣大大提高了篩逸的工作效率。第四十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日第五節溫敏突變株的篩選溫敏突變株（temperature-sensitivemutant,TS突變株）：在許可的溫度下能正常生長，其表型和野生型沒有區別，在非許可的溫度條件下不能生長或微弱生長，表型和野生型不同。第四十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日一溫敏突變株的特性1、主要是必須基因的突變2、錯義突變或移碼突變二溫敏突變株的篩選方法1、誘發抗生素法2、富集過濾或離心法H3-前體法3、分離篩選常規法和特殊分離篩選第五十頁，共五十九頁，2022年，8月28日第五十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日三溫敏突變株在發酵工業中的應用1、TS突變株在谷氨酸的發酵中的應用2、TS突變株在絲氨酸發酵中的應用3、微生物單細胞蛋白的生產第五十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日第六節抗噬菌體菌株的選育一、烈性噬菌體及其效價的測定一般情況下每種噬菌體所形成噬菌斑的形態是相對穩定的，但有時也隨著寄主生理狀態、菌齡及培養條件不同而變化。噬菌斑的這些形態特征可以作為鑒定指標，也可利用其進行純種分離和計數。每毫升試樣中所含有的侵染性的噬菌體粒子數稱為效價，以下是幾種噬菌體的分離和效