第九章

植物胚胎培養與人工種子第一節植物胚胎培養第二節人工種子第一節植物胚胎培養植物胚胎培養包括幼胚培養、成熟胚培養、胚珠培養、子房培養、胚乳培養和試管受精等內容。植物胚胎結構一、胚胎培養概念1、胚胎培養指使胚或具胚器官在離體無菌條件下發育成幼苗的技術。廣義胚胎培養研究還包括胚乳培養和試管受精等技術。胚電鏡掃描圖片2、胚培養指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養基上進行離體培養的方法。雙子葉植物胚3、胚乳培養指處于細胞期的胚乳組織的離體培養。4、胚珠培養指未受精或受精后的胚珠離體培養。不同植物的胚珠形態結構倒生胚珠5、子房培養指授粉和未授粉的子房培養。它對于研究果實發育的生理、離體受精等有重要意義。6、試管受精指在無菌條件下培養離體的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌發產生的花粉進入胚珠而完成受精過程。二、胚胎培養的應用1、克服遠緣雜交的不育性，獲稀有雜種植物2、打破種子休眠，提早結實，縮短育種年限3、使生活力低下或無生活力的種子萌發4、使柑橘類植物合子胚正常發育5、測定種子生活力6、獲三倍體或單倍體植株7、快速繁殖特殊植物8、用于理論研究指在無菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來，置于培養基上進行離體培養的方法。三、胚的培養植物胚結構胚電鏡掃描圖片雙子葉植物胚幼胚培養成熟胚培養

據培養目的不同剝取的離體胚發育時期的不同胚培養成熟胚培養一般較易獲得成功（一）幼胚培養幼胚完全是異養的，離體條件下培養要求培養基成分復雜，培養不易成功。

幼胚培養時，其發育過程有以下幾種發育方式：a、胚性發育，此種方式不能萌發成苗b、早熟萌發，長成的苗十分瘦弱c、產生愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚或不定芽（二）成熟胚培養成熟胚是自養的，培養基需要簡單。主要目的:◆研究胚發育過程的形態建成◆生長調節物質的作用◆胚與胚乳相互關系和營養要求培養方法：A、將受精后成熟或未成熟種子或果實，用70%—75%酒精表面消毒消毒幾分鐘B、用0.1%升汞溶液或飽和漂白粉溶液消毒10min，無菌水反復沖洗C、無菌操作臺上，直接或在解剖鏡下剝取胚接種在培養基上

胚齡胚長度（μm）營養需要（培養基營養）早球形胚后球形胚心形胚魚雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大極限）小于40μm長的胚所需營養尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%薺菜不同發育時期胚培養的營養需要胚乳是由兩個單倍的極核和一個單倍的精子結合而成的3倍體組織。由它可獲得無子結實的3倍體植株，進而可將它加倍成6倍體植株。

不同胚乳發育類型及發育時期直接影響外植體取材時期以及胚乳細胞產生愈傷組織頻率。胚乳培養的后代，常發生細胞染色體數目變化，形成多倍體、非整倍體等。四、胚乳培養1、核型胚乳

◆被子植物中普遍的胚乳發育形式◆初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴隨壁的形成◆各個胚乳核呈游離狀態分布在胚囊中◆發育到一定階段后，常在胚囊外圍的胚乳核之間出現細胞壁

◆為單子葉植物和具有離瓣花的雙子葉植物中普遍存在，如小麥、水稻、玉米、棉花、油菜、蘋果等（一）胚乳的發育類型2、細胞型胚乳

特點：◆初生胚乳核的分裂開始，即產生細胞壁，形成胚乳細胞◆無游離核時期大多數雙子葉合瓣花植物是這樣的胚乳，如番茄、煙草、芝麻等。3、沼生目型胚乳

◆核型胚乳與細胞型胚乳的中間類型◆初生胚乳核的第一次分裂將胚囊分隔為兩室，其中珠孔端室比合點端室寬大◆核進行分裂形成狀態的游離核，最后形成細胞（二）胚乳培養的關鍵A、胚乳發育時期的影響發育早期胚乳：操作不便，誘導率低游離核期或剛轉入細胞期的核型胚乳：難得callus旺盛生長期胚乳：易誘導產生callus★旺盛期胚乳特征

§胚已分化完成

§胚乳已形成細胞組織

§充分生長，達到成熟大小

§外觀為半透明的固體狀

§富有彈性水稻：授粉后4d黑麥草：授粉后8~10d黃瓜：授粉后7~16d梨：授粉后20d大麥：授粉后10~20d玉米和小麥：授粉后8~12d一些草本植物胚乳培養的適宜取材時期一般情況下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus誘導率很低，甚至無callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和誘導產生callusB、培養基和激素的影響培養基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要

激素：要求特殊大麥胚乳只有在添加2，4-D的培養基上才能生長獼猴桃胚乳培養中，玉米素最好棗的胚乳培養中，激素似乎無特殊要求C、其他因素的影響蔗糖濃度：3%~5%溫度：25℃pH值：如玉米6.1~7.0；蘋果6.0~6.2等（三）培養方法：A、取授粉4-8d后的幼果，常規消毒B、無菌條件下切開果實，取出種子，分離出胚乳C、接種在培養基上，在25-27℃和黑暗條件或散射光下培養形成愈傷組織D、轉到分化培養基上，待愈傷組織長出芽后，切下不定芽E、插入生根培養基中，光下培養10-15d，切口處長出白色的不定根※兩種植物胚乳培養的方法A、枸杞開花20d的枸杞胚乳MS+2，4-D0.2mg/L生根MS分化出苗MS+BA0.2mg/L不同倍性的胚乳植株callusB、葡萄取出種子切去合點部分接種White+CM10%+2，4-D2.0+CH500+KT1.0+蔗糖3%~4%瓊脂8%1個月，胚乳愈傷組織長大，胚解體未授粉胚珠和子房培養是離體受精的基礎，可誘發大孢子發育成單倍體植株，且孤雌產生的單倍體植株獲得率較孤雄生殖高。胚珠培養中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培養成種子，且培養基及添加成分相對要求不高。而受精不久的胚珠則需要成分復雜的培養基，培養難度大。

五、胚珠和子房培養1、胚珠培養的意義有利于合子和早期原胚的培養胚分化不全的種子的胚培養獲得雜交后代和優良品種離體授粉的需要獲得無病毒苗（一）胚珠培養不同植物的胚珠形態結構2、胚珠培養的方法長度小于3mm的胚珠，難與直接解剖，可先接種于液體培養基中，根據培養情況采取相應培養條件。（二）子房培養1、子房培養的意義

★有效地挽救雜種胚的敗育★單倍體植株的培育★離體授粉的需要★離體條件形成果實★花被功能研究2、子房培養的方法授粉或授粉后的子房表面消毒接種培養受精后的子房仍需進行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無菌條件下直接剝取子房接種。子房培養只需較簡單的培養基即可形成果實，并含成熟種子。六、植物離體授粉受精離體受精技術的突破的技術前提：a、雌配子和雄配子分離技術b、單對原生質體融合技術c、微培養技術開花前數天套袋，開花前一天或當天取花蕾或花藥，表面消毒后，無菌條件下收集花粉。采用直接引入法、注射法進行子房試管授粉，或者是采用哺育法、接近法進行胚珠試管授粉。1、離體受精方法胚珠花粉試管內授粉10d后胚珠培養3周后離體受精及植株再生過程2、技術關鍵A、花粉的采集和滅菌

★確定開花、花藥分裂、授粉、花粉管進入胚珠和受精作用時間★去雄后將花蕾套袋隔離★采集花粉粒★消毒★無菌條件分裂花粉★授粉B、外植體選擇★開花前套袋、去雄★開花后1~2d，采集花蕾，放入無菌室培養準備★切去柱頭，防止不授粉★胚珠剝離時間（開花后1~2d效果好）C、適合的培養基離體受精的主要過程⊙花粉的萌發和花粉管的生長，受精⊙受精胚珠發育為成熟的種子，存在生活力的胚培養基應促進受精后的胚珠正常發育離體受精胚珠培養的改良Nitsch（1951）培養基配方成分數量（mg/L）成分數量（mg/L）成分數量（mg/L）Ca（NO3）24H2O500ZnSO47H2O0.5VB10.25KNO3125MnSO44H2O3.0VB60.25KH2PO4125H3BO30.5煙酸1.25MgSO47H2O125FeC6O5H75H2O10.0蔗糖50000CuSO45H2O0.025Gly7.5瓊脂7000Na2MoO40.025泛酸鈣0.25蔗糖濃度是4%~5%，水解酪蛋白為500mg/L，利于花粉萌發和種子發育3、離體受精障礙★花粉在柱頭上不萌發★花粉管不能進入胚珠★花粉在花柱中破裂★受精后，胚和胚乳之間的不親和性★受精后，胚乳發育不良★雜種胚不能發育成熟七、影響因素1、胚珠（子房）的成活率及育齡離體胚珠（子房）培養的成活率直接影響試管受精的成功率。胚珠（子房）離體成活率的關鍵是培養基成分的篩選。2、母體組織的影響柱頭可影響某些植物受精，應切除柱頭和花柱。而有些植物則需要保留，更有利于離體受精，如煙草。3、花粉萌發和花粉管生長離體花粉萌發率和花粉生長速度直接影響試管受精成功率。

胚齡胚長度（μm）營養需要（培養基營養）早球形胚后球形胚心形胚魚雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大極限）小于40μm長的胚所需營養尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%薺菜不同發育時期胚培養的營養需要第二節人工種子一、人工種子的概念人工種子是指植物離體培養中產生的胚狀體或不定芽包裹在含有養分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中所形成的能發芽出苗的顆粒體。二、人工種子的類型及結構1、人工種子主要包括：a、裸露的或休眠的、經過或未經過干燥處理的繁殖體b、用聚氧乙烯等多聚體包裹的繁殖體c、用水凝膠包裹的繁殖體d、液膠包埋的、用流質播種法播種的體細胞胚2、人工種子的結構（1）胚狀體（或芽）人工種子的胚主要是指體細胞胚，此外還有頂芽、腋芽、小鱗莖等也可以做為人工種子的胚。（2）人工種皮特點：

◆對胚狀體或芽無毒害◆柔軟且有一定機械抗壓能力◆能保持一定水分及營養物◆允許種皮內外氣體交換通暢◆不影響胚萌發突破◆播種后易于化解

目前人工種皮常選用的材料有藻酸鹽等水凝膠、瓊脂糖、角叉膠等。（3）人工胚乳

胚乳是胚胎發育的營養條件，因此人工胚乳的基本成分仍是胚發育所需各類營養成分，此外，還可根據需要添加激素、抗生素、農藥等成分，以提高人工種子的抗性與品質。人工種子1、人工種子結構完整，體積小，便于貯藏與運輸，可直接播種，易于機械化操作；2、不受季節限制，不受環境制約，胚狀體數量多、繁殖快、有利于工廠化生產；三、人工種子的意義3、有利于繁殖生育周期長、自交不親合、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無病毒材料；4、可在人工種子中加入抗生素、農藥、菌肥等成分，提高種子活力和品質；5、體細胞胚由無性繁殖體系產生，可以固定雜種優勢。四、人工種子技術1、胚狀體誘導控制體細胞胚狀體同步發育是制備人工種子的核心問題，可采取抑制劑法、低溫法、滲透壓法、通氣法、分離過篩法等方法促進胚狀體同步生長。2、人工種皮制作

早期的材料是聚氧乙烯，但有一定的毒性且遇水易溶解。后來采用藻酸鹽較多，但易粘連、失水干縮，現在普遍采用在其外面加一層包裹劑如滑石粉、5%CaCO3等的方法來克服。3、人工胚乳的研制

人工胚乳主要包括無機鹽、糖（或淀粉）、蛋白質等成分。對于無胚乳植物的人工種子制作必須加入糖分，同時也要加入防腐劑、抗菌素、農藥等。4、包埋技術