實驗大腸桿菌的培養與分離第一頁，共五十頁，2022年，8月28日實驗目的:1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養基進行細菌培養的操作2.進行大腸桿菌的分離,用固體平板培養基進行細菌的劃線培養3.說明大腸桿菌培養的條件和操作要求的原理第二頁，共五十頁，2022年，8月28日特點：結構都相當簡單,個體多數十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎知識：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．第三頁，共五十頁，2022年，8月28日(二)細菌的常識1、結構2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中的應用第四頁，共五十頁，2022年，8月28日大腸桿菌第五頁，共五十頁，2022年，8月28日細菌的外形與大小大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見的三種細菌典型形態A.球菌B.桿菌C.弧菌第六頁，共五十頁，2022年，8月28日根據細菌所利用的能源和碳源的不同將細菌分為兩大營養類型。自養菌:異養菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌細菌的營養類型光能自養型:光合細菌化能自養型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌大腸桿菌屬于異養兼性厭氧菌第七頁，共五十頁，2022年，8月28日細菌的革蘭氏染色革蘭氏染色法是一種用于細菌的染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌第八頁，共五十頁，2022年，8月28日☆

培養基

培養基（培養液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養液。固體培養基和液體培養基、半固體培養基。1.培養基的類型(三)細菌的培養成分區別：瓊脂第九頁，共五十頁，2022年，8月28日2.不同的微生物往往需要采用不同的培養基配方3.不管哪種培養基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、生長因子等營養物質，另外還需要滿足微生物生長對pH、氧氣、滲透壓的要求．細菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌配方：酵母提取物

0.25g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g瓊脂

1g水:50ml第十頁，共五十頁，2022年，8月28日4.培養基的用途液體培養基：擴增細菌、工業生產固體培養基：純化（分離），鑒定、保藏菌種第十一頁，共五十頁，2022年，8月28日單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態結構的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據?！罹?/p>

第十二頁，共五十頁，2022年，8月28日液體培養基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第十三頁，共五十頁，2022年，8月28日☆無菌技術1.無菌技術的概念

無菌操作泛指在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養微生物的關鍵。第十四頁，共五十頁，2022年，8月28日（１）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區別

（2）滅菌的定義：3.常用的消毒與滅菌的方法是指殺滅大部分病原微生物的方法。是指殺滅或清除環境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法第十五頁，共五十頁，2022年，8月28日消毒的方法：1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒4、氯氣消毒水源5、紫外線消毒……第十六頁，共五十頁，2022年，8月28日滅菌的方法：1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.第十七頁，共五十頁，2022年，8月28日1、灼燒滅菌滅菌的方法：第十八頁，共五十頁，2022年，8月28日2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.第十九頁，共五十頁，2022年，8月28日1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養細菌用的培養基與培養皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考第二十頁，共五十頁，2022年，8月28日實驗用具LB固體培養基大腸桿菌菌液（LB液體培養基）培養皿接種環酒精棉酒精燈鑷子、火柴、記號筆第二十一頁，共五十頁，2022年，8月28日第二十二頁，共五十頁，2022年，8月28日配制培養基包器材滅菌菌種擴增倒平板接種、劃線培養觀察記錄實驗流程第二十三頁，共五十頁，2022年，8月28日二、大腸桿菌的培養和分離實驗操作（一）培養基的配置與滅菌取2個250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養基和50mlLB固體培養基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養基——細菌的擴大培養LB固體培養基——細菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進入第二十四頁，共五十頁，2022年，8月28日（二）倒平板滅菌后的培養基在無菌操作臺上倒入4個培養皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面第二十五頁，共五十頁，2022年，8月28日注意事項：1.培養基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺用超凈紫外燈和過濾風滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染.第二十六頁，共五十頁，2022年，8月28日（三）大腸桿菌的擴大培養將斜面上培養的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養基中,使其在37℃搖床培養12小時。注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環取菌;2.取菌前接種環要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復原.第二十七頁，共五十頁，2022年，8月28日菌種擴增搖床震蕩培養12h（于LB液體培養基中）本圖來自十一學校第二十八頁，共五十頁，2022年，8月28日（四）大腸桿菌的劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法第二十九頁，共五十頁，2022年，8月28日1、劃線分離法無菌操作臺上用接種環取菌后在固體培養基的平板上連續劃線.第三十頁，共五十頁，2022年，8月28日平板劃線的操作第三十一頁，共五十頁，2022年，8月28日不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。第三十二頁，共五十頁，2022年，8月28日一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。第三十三頁，共五十頁，2022年，8月28日第三十四頁，共五十頁，2022年，8月28日第三十五頁，共五十頁，2022年，8月28日（四）大腸桿菌的劃線分離注意事項:1.接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養皿倒置培養12~24h1、劃線分離法第三十六頁，共五十頁，2022年，8月28日第三十七頁，共五十頁，2022年，8月28日問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。第三十八頁，共五十頁，2022年，8月28日2.在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第三十九頁，共五十頁，2022年，8月28日分離后,一個菌體便會形成一個菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一第四十頁，共五十頁，2022年，8月28日2、涂布分離法:是指將培養的菌液稀釋一定的倍數,然后取一定量稀釋液加在固體培養基上,用玻璃刮刀涂布在培養基平面上.第四十一頁，共五十頁，2022年，8月28日第四十二頁，共五十頁，2022年，8月28日劃線分離法和涂布分離法哪個更好呢？劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復雜。第四十三頁，共五十頁，2022年，8月28日（五）大腸桿菌分離后保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法第四十四頁，共五十頁，2022年，8月28日1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌喜堿，喜蛋白質，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度第四十五頁，共五十頁，2022年，8月28日2.在培養后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區別細菌、酵母、放線菌和霉菌關鍵指標。（2）顯微鏡觀察其形態、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區別細菌、酵母、放線菌和霉菌關鍵指標。（3）上述方法較難區別同類的不同物種，需借助化學和進一步的形態觀察，如用革蘭氏染色法等。第四十六頁，共五十頁，2022年，8月28日3.進行恒溫培養時為什么要將培養皿倒置?恒溫培養時，培養基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發，倒放培養皿則會使水蒸氣凝結成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養基表面并擴散開。如果培養皿中已形成菌落，則會導致菌隨水擴散，很難再分成單菌落，達不到分離目的。第四十七頁，共五十頁，2022年，8月28日4.實驗完成后,接種過細菌的器皿應如何處理?所有接觸過菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄第四十八頁，共五十頁，2022年，8月28日5.如果分離的是