11.4蛋白質工程的崛起專題1基因工程2一、蛋白質工程崛起的緣由

通過基因工程能夠大規模生產生物體內微量存在的活性物質，并借助轉基因而改變動植物性狀，得以在人類醫療保健中進行基因診斷和基因治療。然而在廣泛利用自然界各種蛋白質的過程中就發現，這些蛋白質只是適應生物自身的需要，而對它們進行產業化開發往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白質工程，它是指按照特定的需要，對蛋白質進行分子設計和改造的工程。自此以后，蛋白質工程迅速發展，已成為生物工程的重要組成部分。3

在已研究過的幾千種酶中，只有極少數可以應用于工業生產，絕大多數酶都不能應用于工業生產，這些酶雖然在自然狀態下有活性，但在工業生產中沒有活性或活性很低。這是因為工業生產中每一步的反應體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應溫度較高，在這種條件下，大多數酶會很快變性失活。提高蛋白質的穩定性是工業生產中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質的穩定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。4

例如：干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進行表達，產生的干擾素的抗病毒活性為106U/mg，只相當于天然產品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數是以無活性的二聚體形式存在。為什么會這樣？如何改變這種狀況？研究發現，β-干擾素蛋白質中有3個半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測可能是有一個或幾個半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過基因定點突變改變成絲氨酸，結果使大腸桿菌中生產的β-干擾素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩定性高很多。改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外-70℃可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數倍改造改造5倍2倍61、基因工程的應用（1）基因工程的實質：將一種生物的

轉移到另一種生物體內，使后者產生本不能產生的

，進而表現出新的

。（2）基因工程的不足：在原則上只能生產自然界已存在的

。2、天然蛋白質的不足天然蛋白質是生物在長期

過程中形成的，它們的

符合特定物種

的需要，卻不一定完全符合人類生產和生活的需要。3、蛋白質工程的目的生產符合人類生產和生活的需要的

。基因蛋白質性狀蛋白質進化結構和功能生存蛋白質7“后基因組時代”將是“蛋白質組學時代”，即從對基因信息的研究轉向對蛋白質信息的研究，包括研究蛋白質結構、功能與應用及蛋白質相互關系和作用。蛋白質工程就是在對蛋白質的化學、晶體學、動力學等結構與功能認識的基礎上，對蛋白質人工改造與合成，最終獲得商業化的產品。8二、蛋白質工程的基本原理基因DNAmRNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質三維結構轉錄翻譯生物功能預期功能折疊分子設計DNA合成蛋白質工程中心法則流程圖9例1.科學家將β－干擾素基因進行定點突變導入大腸桿菌表達，使干擾素第17位的半胱氨酸改變成絲氨酸，結果大大提高了β－干擾素的抗病活性，并且提高了儲存穩定性。該生物技術為A.基因工程B.蛋白質工程C.基因突變D.細胞工程B10蛋白質工程的概念基礎:實質：途徑:目標:蛋白質的結構和功能基因修飾或基因合成

改造或制造新的蛋白質，滿足人類的生產或生活的需要是對編碼蛋白質的基因進行改造11例2.以下關于蛋白質工程的說法正確的是（）A、蛋白質工程以基因工程為基礎B、蛋白質工程就是酶工程的延伸C、蛋白質工程就是用蛋白酶對蛋白質進行改造D、蛋白質工程只能生產天然的蛋白質A12蛋白質工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了

解蛋白質的二維重組和三維晶體結構;（4）設計各種處理條件，了解蛋白質的結構變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。13異亮氨酸半胱氨酸14基因定點誘變技術的示意圖15基因定點誘變技術的理解(蘇教版)項目內容條件原料酶引物能量

ＡＴＰ操作方法

ＰＣＲ法結果適應范圍后代中半數為誘變的ＤＮＡ分子脫氧核苷酸ＤＮＡ聚合酶和ＤＮＡ連接酶含突變順序的ＤＮＡ分子片段空間結構完全清楚的蛋白質16思考：基因定點誘變技術與基因突變的比較比較基因定點誘變基因突變相同點發生的過程結果不同點場所手段方向DNA復制過程中產生新基因，從而產生新性狀生物體外生物體內定向改造不定向性PCR技術物理化學方法171、目標：根據人們對

功能的特定需求，對蛋白質的

進行分子設計。2、原理：改造基因（基因

或基因

）。3、途徑：預期蛋白質功能→設計

→推測應有的

序列→找到對應的

序列。蛋白質結構修飾合成預期的蛋白質氨基酸脫氧核苷酸

對天然蛋白質進行改造，你認為直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現？18（一）蛋白質的分子設計與改造蛋白質工程首先是以蛋白質的結構為基礎，通過蛋白質的一級結構、晶體結構和溶液構象的研究，積累了成千上萬蛋白質一級結構和高級結構的數據資料，并編制成系統的數據庫，得以從中找出蛋白質分子間的進化關系、一級結構和高級結構的關系、結構與功能的關系方面的規律。19

蛋白質作為生物大分子是生物化學和分子生物學的研究重點，大量蛋白質被分離純化，測定了它們的結構、性質和生物學作用。分子生物學有關基因組的研究，也可以用以推測出一些未知蛋白質的結構與功能。采用定位誘變的方法，可以對編碼蛋白質的基因進行核苷酸密碼子的插入、刪除、置換和改組，其結果為分子改造提供新的設計方案。現有的蛋白質是生物長期進化的結果，蛋白質工程則是對生物進化的模擬，按照蛋白質形成的規律，改造蛋白質或構建新的蛋白質。20

蛋白質的改造通常需要先經周密的分子設計，然后依賴基因工程獲得突變型蛋白質，以檢驗其是否達到了預期的效果。如果改造的結果不理想，還需要重新設計再進行改造，往往經歷多次實踐摸索才能達到改進蛋白質性能的預定目標。21（二）蛋白質改造工程舉例1．水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑，它有多種變異體，由65或66個氨基酸殘基組成。水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病。為提高水蛭素活性，在綜合各變異體結構特點的基礎上提出改造水蛭素主要變異體HV2的設計方案，將47位的Asn（天冬酰胺）變成Lys（賴氨酸），使其與分子內第4或第5位Thr（蘇氨酸）間形成氫鍵來幫助水蛭素N端肽段的正確取向，從而提高凝血效率，試管試驗活性提高4倍，在動物模型上檢驗抗血栓形成的效果，提高20倍。222．生長激素改造生長激素通過對它特異受體的作用促進細胞和機體的生長發育，然而它不僅可以結合生長激素受體，還可以結合許多種不同類型細胞的催乳激素受體，引發其他生理過程。在治療過程中為減少副作用，需使人的重組生長激素只與生長激素受體結合，盡可能減少與其他激素受體的結合。經研究發現，二者受體結合區有一部分重疊，但并不完全相同，有可能通過改造加以區別。由于人的生長激素和催乳激素受體結合需要鋅離子參與作用，而它與生長激素受體結合則無需鋅離子參與，于是考慮取代充當鋅離子配基的氨基酸側鏈，如第18和第21位His（組氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。實驗結果與預先設想一致，但要開發作為臨床用藥還有大量的工作要做。233．胰島素改造天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素β23-β28氨基酸殘基結構所致。利用蛋白質工程技術改變這些殘基，如β28位改為賴氨酸、β29位改為脯氨酸，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過臨床實驗。244．治癌酶的改造癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細胞，特異性地抑制或殺死癌細胞；藥物保護正常細胞免受化學藥物的侵害，可以提高化學治療的劑量。皰疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它結構類似物磷酸化而使這些堿基3’-OH缺乏,從而阻斷DNA的合成，殺死癌細胞。HSV—TK催化能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機突變中進行篩選出一種酶,在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力20倍以上。25

蛋白質工程的發展很快，研究工作很多，以上僅介紹了幾個例子。蛋白質工程除了用于改造天然蛋白質或設計制造新的蛋白質外，其本身還是研究蛋白質結構功能的一種強有力的工具，它在解決生物理論方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并論。26例3.干擾素是動物體內的一種蛋白質，可以用來治療病毒的感染和癌癥，但在體外保存相當困難，如何長期保存，科學家發現干擾素中的一個半胱氨酸變成絲氨酸，可以保存半年。你來設想一下，能不能讓動物生產能夠長期儲存的干擾素？采用什么方法？

能生產長期儲存的干擾素。用氨基酸序列反推信使RNA序列，再反推DNA序列，然后進行基因改造。27何謂蛋白質工程？

在現代生物技術中，蛋白質工程出現得最晚，是在20世紀80年代初期出現的。1983年“蛋白質工程”這個名詞出現后，隨即被廣泛接受和采用。蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。28

對照密碼表，至少寫出三種決定“—丙氨酸—色氨酸—賴氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—”的脫氧核苷酸序列。討論（1）mRNA序列為：

GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）脫氧核苷酸序列：

CGA（或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）（2）確定目的基因的堿基序列后，就可以根據人類的需要改造它，通過人工合成的方法或從基因庫中獲取。29起始密碼30比較項目基因工程蛋白質工程程序上合成的是否是自然蛋白質順著中心法則逆著中心法則是不是蛋白質工程和基因工程的區別31項目蛋白質工程基因工程區別原理中心法則的逆推基因重組過程預期蛋白質功能→設計蛋白質結構→推測氨基酸序列→推測脫氧核苷酸序列→合成DNA→表達出蛋白質獲取目的基因→構建表達載體→導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定實質定向改造或生產人類所需蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品(基因的異體表達)結果生產自然界沒有的蛋白質生產自然界中已有的蛋白質聯系蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，因為對現有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成實現重組創新321.進展胰島素速效型藥品2.前景制作電子元件3.現狀蛋白質工程目前成功的例子不多,原因是對蛋白質的高級結構了解不夠。要設計出更加符合人類需求的蛋白質還需經過艱辛的探索。應用于微電子方面具耗電少和

的特點體積小效率高三、蛋白質工程的進展和前景如β28位改為賴氨酸、β29位改為脯氨酸，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。33例4.某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結構和功能很相似，只有對熱穩定性較差，進入人體后容易失效。現要將此酶開發成一種片劑，臨床治療食物的消化不良，最佳方案是A.對此酶中的少數氨基酸替換，以改善其功能B.將此酶與人蛋白酶進行拼接，形成新的蛋白酶C.重新設計與創造一種全新的蛋白酶D.減少此酶在片劑中的含量A341、下列關于蛋白質工程的說法錯誤的是A．蛋白質工程能定向改造蛋白質分子的結構，使之更加符合人類的需要B．蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變分子的結構C．蛋白質工程能產生出自然界中不曾存在過的新型蛋白質分子D．蛋白質工程與基因工程密不可分，又被稱為第二代基因工程B練習353、下列各項中不屬于蛋白質工程在醫學上應用的是（）A.基因芯片用于HIV診斷B.t-PA用于醫治心肌梗死C.速效胰島素用于治療糖尿病D.人—鼠嵌合抗體用于識別、殺傷腫瘤細胞2、蛋白質工程中直接需要進行操作的對象是A．氨基酸結構B．蛋白質空間結構C．肽鏈結構D．基因結構DA364、蛋白質工程的基本流程正確的是①蛋白質分子結構設計②DNA合成③預期蛋白質功能④根據氨基酸序列推出脫氧核苷酸序列A．①②③④B．④②①③C．③①④②D．③④①②C375、蛋白質工程是在基因工程基礎上，延伸出來的第二代基因工程，其結果產生的蛋白質是A．氨基酸種類增多B．氨基酸種類減少C．仍為天然存在蛋白質D．可合成天然不存在蛋白質D386、枯草桿菌產生的蛋白酶具有催化分解蛋白質的特性，但極易被氧化而失效。1985年，美國的埃斯特爾將枯草桿菌蛋白酶分子中的第222位氨基酸替換后，雖然其水解活性有所下降，但抗氧化能力大大提高。用這種水解酶作為洗滌劑的添加劑，可以有效地除去血漬、奶漬等蛋白質污漬。（1）改造枯草桿菌蛋白酶的生物技術是

。（2）改造后的枯草桿菌中的控制合成蛋白酶的基因與原來相比，至少有

個堿基對發生變化。（3）利用生物技術改造蛋白質，是提高了蛋白質的

性，埃斯特爾所作的工作是對已知蛋白質進行

。蛋白質工程1穩定少數氨基酸的替換39思考與探究（P28）1.解析：蛋白質工程的崛起主要是工業生產和基礎理論研究的需要。而結構生物學對大量蛋白質分子的精確立體結構及其復雜的生物功能的分析結果，為設計改造天然蛋白質提供了藍圖。分子遺傳學的以定點突變為中心的基因操作技術為蛋白質工程提供了手段。在已研究過的幾千種酶中，只有極少數可以應用于工業生產，絕大多數酶都不能應用于工業生產，這些酶雖然在自然狀態下有活性，但在工業生產中沒有活性或活性很低。這是因為工業生產中每一步的反應體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應溫度較高，在這種條件下，大