RNA的提取和cDNA合成原理和實驗方法第一節.概述從真核生物的組織或細胞中提取mRNA，通過酶促反響逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，將雙鏈cDNA和載體連接，然后轉化擴增，即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的構造、表達和調控的分析；比擬cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的根本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來，已開展了許多種提高cDNA合成效率的方法，并大大改良了載體系統，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的根本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈，聚合酶合成cDNA第二鏈，參加合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當載體(噬菌體或質粒)。一.RNA制備模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的構造特點，容易受RNA酶的攻擊反響而降解，加上RNA酶極為穩定且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性，這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換〔使用一次性手套〕。所用的玻璃器皿需置于枯燥烘箱中2T烘烤2小時以上。但凡不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈°DEPC是RNA酶的化學修飾劑，它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反響而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物，因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理，參加DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌吟作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反響，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾的試劑。除DEPC夕卜,也可用異硫氯酸胍、機氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了防止mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經硅烷化處理。細胞總RNA制備方法很多，如異硫氯酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質量的總RNA。別離的總RNA可利用mRNA3'末端含有多聚(A)+的特點，當RNA流經oligo(dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70P可保存一年以上。二.cDNA第一鏈的合成所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反響。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中別離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有假設干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA局部進展切降解(RNA酶H活性)MLV反轉錄O酶只有單個多肽亞基，兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱，且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值，最適鹽濃度和最適溫室各不一樣，所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成°cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3'端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。三.cDNA第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種：自身引導法合成的單鏈cDNA3'端能夠形成一短的發夾構造，這就為第二鏈的合成提供了現成的引物，當第一鏈合成反響產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈，最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環，即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反響，而且用S1核酸酶切割發夾構造時無一例外地將導致對應于mRNA5'端序列出現缺失和重排，因而該方法目前很少使用。置換合成法該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切和缺。從而產生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物，在大腸桿菌DNA聚合酶1的作用下合成第二鏈。該反響有3個主要優點：(1)非常有效；(2)直接利用第一鏈反響產物，無須進一步處理和純化；(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發夾環。目前合成cDNA常采用該方法。四.cDNA的分子克隆已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質?；蚴删w中，為此，首先必需連接上接頭(Linker)，接頭可以是限制性切酶識別位點片段，也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴，退火后形成重組質粒，并轉化到宿主菌中進展擴增。合成的cDNA也可以經PCR擴增后再克隆入適當載體。第二節.動植物組織mRNA的提取一、材料水稻葉片或小鼠肝組織。二、設備研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空枯燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶〔180。。2小時〕裝蒸餾水，然后參加0.01%的DEPC〔體積/體積〕，處理過夜后高壓滅菌。2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，〔用高溫滅菌器皿配制〕，然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、M層析柱加樣緩沖液；20mmol/LTrisCl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1%SDS。4、洗脫緩沖液：10mmol/LTrisCl(pH7.6)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.05%SDS。四、操作步驟〔一〕動植物總RNA提取-Trizol法Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+別離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-1mg組織參加1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液參加0.2ml的比例參加氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。3、取上層水相于一新的離心、管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例參加異丙醇，室溫放置10分鐘，120g離心10分鐘。4、棄去上清液，按每mlTrizol液參加至少1ml的比例參加75%乙醇，渦旋混勻，4。下75g離心5分鐘。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空枯燥5-10分鐘，注意不要枯燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55°C-60°C水溶10分鐘。RNA可進展mRNA別離，或貯存于70%乙醇并保存于-70C。［注意］1、整個操作要帶罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。2、加氯仿前的勻漿液可在-70C保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保存一周，-20C保存一年?！捕砿RNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑。ligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在。ligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次。ligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。1、用0.1mol/LNaOH懸浮0.5-1.0goligo(dT)纖維素。2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、用1*柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、將〔一〕中提取的RNA液于65C溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，參加等體積2*柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，參加1倍柱床體積的1*層析柱加樣溶液。5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，參加2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。7、參加1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20C30分鐘。8、4C下120g離心15分鐘，小心、棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4C下120g離心5分鐘。9、小心棄去上清液，沉淀空氣枯燥10分鐘，或真空枯燥10分鐘。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成〔或保存在70%乙醇中并貯存于-70C〕。［注意］1、mRNA在70%乙醇中-70C可保存一年以上。2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并參加0.02%疊氮鈉〔NaN3〕冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節植物病毒RNA提取大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性一樣，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。一、材料提純TMV病毒液〔10mg/ml〕。二、設備冷凍臺式離心機，低溫真空枯燥儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑TE-飽和酚:氯仿〔1:1〕，氯仿，3MNaAc(pH5.2)，乙醇(1%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。四、操作步驟1、取一eppendorf管參加提純TMV〔10mg/ml〕4ml，再參加等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4C下120g離心10分鐘。2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。3、吸取水相于新eppendorf心管，參加等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4，C下120g離心10分鐘。4、取水相，參加1/10倍體積的3mol/LNaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20C30分鐘。5、4C下120g離心15分鐘，小心、棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4C下120g離心5分鐘。6、小心棄去上清液，沉淀真空枯燥5分鐘或空氣枯燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。7、取10ml進展電泳分析，另10ml用于cDNA合成。[注意]1、整個操作應盡可能在低溫下進展。2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要屢次進展酚/氯仿的抽提。第四節cDNA合成技術一、RibocloneM-MLV(H-)cDNA合成技術Promega公司的RibocloneRM-MLV(H-)cDNA合成系統采用M-MLV反轉錄酶的RNaseH缺失突變株取代AMV反轉錄酶，使合成的cDNA更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV反轉錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶I進展置換合成,最后用T4DNA聚合酶切去單鏈末端，方法簡便易行。該系統試劑包括：Pg特異性引物2plM-MLV第一鏈緩沖液(5方，配方如下：250mmol/LTrisClpH8.3(37C時)；375mmol/lKCl;15mmol/LMgCl2;50mmol/LDTT;10mmol/LdATP,dCTP,dGTP,dTTP混合物(各2.5mmol/L)2>625prRNasinRRNA酶抑制劑10,0pM-MLV反轉錄酶，RNaseH-5ng對照RNA4plM-MLV第二鏈緩沖液(10方，配方如下：4mmol/LTrisCl,pH7.2;850mmol/LKCl;44mmol/LMgCl2;30mmol/LDTT;0.5mg/mlBSA。5pRNaseH5pDNA聚合酶I1pT4DNA聚合酶I2>1.25ml不含核酸酶的水以上所有試劑除對照RNA需在-70C保存外，其余均可保存于-20C，可以合成40pgmRNA。〔一〕第一鏈合成1.試劑[a-32P]dCTP(>4Ci/mmol)，EDTA(50mM和2mM)，TE-飽和酚:氯仿〔1:1〕，7.5MNH4Ac，乙醇(1%和70%)，TE緩沖液。2.操作步驟取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，參加RNA模板和適當引物，每pgRNA使用0.5pg引物(如使用NotI引物接頭，使用0.3pg),用H2O調整體積至15pl,70C處理5分鐘，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次參加5>第一鏈緩沖液5plrRNasinRNA酶抑制劑25UM-MLV(H-)反轉錄酶2UH2O調至總體積25pl用手指輕彈管壁，吸取5pl至另一eppendorf管，參加2-5pCi[a-32P]dCTP(＞4Ci/mmol),用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。37T(隨機引物)或42T(其它引物)溫浴1小時取出置于冰上摻入測定的eppendorf管參加95nl50mMEDTA終止反響，并使總體積為1p1?？扇?0pl進展電泳分析(先用苯酚抽提)，另10pl進展同位素摻入放射性活性測定。第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成注：以上25pl反響總體積中所用RNA量為1pg，如合成5pgRNA，則可按比例擴大反響體積，倒5pgRNA使用125pil總體積進展合成。〔二〕第二鏈合成1、取第一鏈反響液20pl，再依次參加10＞第二鏈緩沖液20plDNA聚合酶123pRNaseH0.8pH2O加至終體積為1pl2、輕輕混勻，如需進展第二鏈同位素摻入放射性活性測定，可取出10pl至另一eppendorf管，參加2-5pCi[a-32P]dCTP。3、14T溫浴2小時(如需合成長于3kb的cDNA，則需延長至3-4小時)。4、摻入測定eppendorf管中參加90pl50mMEDTA，取10pl進展同位素摻入放射性測定，余下的可進展電泳分析。5、cDNA第二鏈合成離心管反響液70P處理10分鐘，低速離心后置冰上。6、參加2pT4DNA聚合酶，37°C溫浴10分鐘。7、參加10pl2mmol/LEDTA終止反響。8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反響液，離心2分鐘。9、水相移至另一eppendorf管，參加0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉，pH5.2)，混勻后再參加2.5倍體積的冰冷乙醇(-20C)，-20C放置30分鐘后離心5分鐘。10、小心丟去上清液，參加0.5ml冰冷的70%乙醇，離心2分鐘。11、小心移去上清液，枯燥沉淀。12、沉淀溶于10-20plTE緩沖液?！踩惩凰負饺敕派湫曰钚詼y定、計算和電泳分析試劑1mg/ml鮭魚精DNA,三氯乙酸(TCA，5%和7%),堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，〔30mMNaOH,1mMEDTA〕，2＞樣品緩沖液，〔20mMNaOH,20%甘油，0.025%溴酚藍〕。操作步驟各取一2(5)中和二⑷反響液各3pl，點于玻璃纖維濾紙，室溫枯燥，這些樣品代表總放射性活性。同樣各取3pl中反響液至含有1pl(1mg/ml)鮭魚精DNA中，混勻，參加0.5ml5%TCA，渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。用玻璃纖維濾紙過濾，用冰冷的5%TCA洗三次，每次用5mlTCA，再用5ml丙酮或乙醇漂洗，這些樣品代表摻入放射性活性。分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度，可用蓋革計算器，也可用液閃計數。3.第一鏈產量測定第一鏈摻入率(%)=摻入cpm/總cpm>1%摻入dNTP(nmol)=2nmoldNTP/pl阪響體積(pl)>(第一鏈摻入率)設330為每moldNTP的平均分子量合成cDNA量(ng)=摻入dNTP(nmol)>330ng/nmolmRNA向cDNA轉變率=合成cDNA量(ng)/模板RNA量(ng)>1%例如總放射性活性強度為254,0cpm,摻入放射性活性強度為3040cpm,所用RNA摸板量為1ng,反響體積為25pl,則：摻入率=3040/2540>1%=1.2摻入dNTP量=2nmoldNTP/pl>25>1.2%=0.6nmol合成cDNA量=0.6nmoldNTP>330ng/nmol=198ngmRNA向cDNA轉變率=198nm/10ng彳%=19.8%由于10ngRNA中20%(5nl/25nl)用于摻入測定，而反響體積占總體積80%,因而實際第一鏈cDNA合成量為0.8>198ng=158ngo第二鏈產量計算除需去除第一鏈摻入dNTP夕卜，方法同第一鏈產量計算第二鏈摻入率=摻入放射性活性/總放射性活性““摻入dNTP量(nnol)=[0.4nmoldNTP/^l>反響體積(nl)-第一鏈摻入nmol]>第二鏈摻入率第二鏈cDNA合成量(ng)=nmoldNTP>330ng/nmol雙鏈cDNA轉變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/單鏈cDNA合成