第2節(jié)

動物細胞工程第1課時動物細胞培養(yǎng)回顧：植物細胞工程常用的技術手段有哪些？植物組織培養(yǎng)、植物體細胞雜交這些技術的理論基礎：植物細胞的全能性動物細胞全能性如何？動物細胞核具有全能性動物細胞工程常用技術動物細胞培養(yǎng)動物細胞工程動物細胞工程是應用細胞學的方法，按照我們人類的需要和預定的設計，有目的、有計劃地保存、改變動物細胞和創(chuàng)造新的動物細胞，進而培育成新的物種或者品種的一門科學技術。是其他動物細胞工程技術的基礎動物細胞融合

動物細胞核移植

如：人造皮膚的構建、動物分泌蛋白的規(guī)模化生產如：制備單克隆抗體如：克隆動物動物細胞培養(yǎng)從動物機體中取出相關組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖的技術。動物細胞培養(yǎng)的原理動物細胞培養(yǎng)時，能否像植物組織培養(yǎng)那樣將動物細胞培養(yǎng)成完整個體？為什么？動物細胞培養(yǎng)的原理是什么？動物細胞特點分化潛能變窄：動物細胞的全能性隨著細胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄，這是指整體細胞而言。細胞核仍具有全能性：細胞核含有保持物種遺傳性所需的全套基因，而且并沒有因細胞分化而丟失基因，因此高度分化動物細胞的細胞核仍具有全能性。不能得到完整個體，得到的是細胞或細胞產物動物細胞培養(yǎng)原理：細胞增殖動物細胞培養(yǎng)的基本條件多細胞動物和人體的細胞都生活在內環(huán)境中，根據(jù)你所學的內環(huán)境的知識，閱讀資料分析培養(yǎng)時又需要提供哪些必要條件呢？【資料1】培養(yǎng)的細胞就像體內細胞一樣，需要一些基本的營養(yǎng)物質和生長因子，如氨基酸、葡萄糖、無機鹽、維生素、核苷酸等。不同組織來源的細胞需要不同的生長因子，而且需求量也不同，所以必須精心設計這些成分的搭配比例。充足的營養(yǎng)：

培養(yǎng)基中應含有細胞所需要的各種營養(yǎng)物質，通常還要添加血清。動物細胞培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基）的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機鹽）、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等為什么探究動物細胞培養(yǎng)時，要在培養(yǎng)基中加入血清、血漿等天然成分？血清和血漿中含有多種維持細胞正常代謝和生長的物質，如蛋白質、氨基酸、未知的促生長因子等，人體細胞所需的營養(yǎng)物質還沒有完全搞清楚。因此細胞培養(yǎng)時，為保證細胞能順利生長和繁殖，一般需添加血清、血漿等天然成分【資料3】人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝就會受到影響。培養(yǎng)的細胞對低溫的耐受能力高于對高溫的耐受力。【資料4】開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣和5%二氧化碳組成的氣體環(huán)境中。氧氣參與細胞的呼吸作用，二氧化碳可以調節(jié)、維持培養(yǎng)基的pH。大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2-7.4。適宜的溫度、pH和滲透壓：（36.5℃±0.5℃，pH（7.2-7.4）

氣體環(huán)境：氣體主要有O2和CO2，O2是細胞代謝所必需，CO2維持培養(yǎng)液PH。采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶于95%空氣+5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。【資料2】細菌、真菌和病毒等均可造成細胞培養(yǎng)環(huán)境的污染，而離體培養(yǎng)的細胞已經失去了對微生物和有毒物質的防御能力，一旦受到污染或有毒自身代謝產物積累等，培養(yǎng)的細胞就會死亡。無菌、無毒環(huán)境：對培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具進行滅菌、無菌環(huán)境下操作、同時培養(yǎng)液需定期更換，清除細胞代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞造成傷害。

動物細胞培養(yǎng)的基本條件其它條件：環(huán)境條件是無菌、無毒的環(huán)境、適宜的溫度、pH和滲透壓、適宜的氣體環(huán)境充足的營養(yǎng)供給：糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等營養(yǎng)條件：如何進行體外動物細胞培養(yǎng)?動物細胞培養(yǎng)的過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸液10代細胞50代細胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細胞加培養(yǎng)液原代培養(yǎng)機械的方法或胰蛋白酶或膠原蛋白酶剪碎細胞株細胞系遺傳物質未改變遺傳物質已改變（分解細胞間質）洗滌、稀釋、分離10代以內，保持正常二倍體核型細胞增殖緩慢，核型可能變化（初次培養(yǎng)）（分瓶后的培養(yǎng)）幾個有關概念：原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。（將分瓶之前的細胞培養(yǎng)，即動物組織經處理后的初次培養(yǎng)，稱為原代培養(yǎng)。）傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。思考1.為什么選擇幼齡動物組織、器官？幼齡動物組織細胞的增殖能力強，有絲分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越強，越容易培養(yǎng)。2.剪碎組織塊的目的？動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。剪碎組織塊有利于動物組織充分接觸胰蛋白酶。3.進行動物細胞培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是什么成分？用胃蛋白酶可以嗎？為什么？

用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。不可以用胃蛋白酶。多數(shù)動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2~7.4,胃蛋白酶（pH為0.9~1.5)在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適用于細胞培養(yǎng)時的處理。

胰蛋白酶不會把細胞消化掉，但會對細胞產生一定的影響。任何酶都要適應一定的環(huán)境，在人體中尤其重要的是pH，胰蛋白酶產生的時候，是沒有生物活性的，當它從胰腺細胞中被分泌出來后進入小腸中，遇到合適的pH但有了生物活性，才能消化蛋白質，而小腸黏膜對小腸上皮細胞又有保護作用，所以胰蛋白酶不不會把細胞消化掉的。在細胞工程中人們普遍使用胰蛋白酶來分散細胞，由于此時酶是處在最有利的環(huán)境中，所以在分解細胞間質蛋白的同時，也會對細胞產生一定的影響，（當然不會把細胞完全消化掉），所以在細胞培養(yǎng)過程中使用胰蛋白酶要注意使用的量和時間。4.胰蛋白酶會不會把細胞消化掉？5.動物細胞培養(yǎng)為什么要把組織分散成單個細胞？貼壁細胞的生長增殖除上述因素影響外，還會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象。細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。接觸抑制——當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。體外培養(yǎng)的動物細胞分為兩類（1）懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖（2）貼附于某些基質表面生長增殖（此現(xiàn)象叫細胞貼壁）懸浮培養(yǎng)的細胞會因細胞密度過大、有害代謝物積累、培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質缺乏等因素而分裂受阻。細胞貼壁過程接觸抑制

(contactinhibition)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附。6.分散細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的特點是什么？接觸抑制與細胞表面什么結構有關？癌細胞是否存在接觸抑制？①細胞貼壁②有絲分裂③接觸抑制④原代培養(yǎng)一般在同一個培養(yǎng)瓶內細胞的接觸抑制細胞培養(yǎng)時，正常細胞增加到一定的密度就不再生長。這種對生長的抑制作用，叫接觸抑制。腫瘤細胞失去的接觸抑制，在培養(yǎng)基里，密度比正常細胞高得多。這種抑制和細胞表面的糖鏈有很大的關系。7.如何解決接觸抑制的問題繼續(xù)擴大培養(yǎng)？如何傳代培養(yǎng)？進行傳代培養(yǎng)，原因是原代培養(yǎng)時會出現(xiàn)細胞貼壁和接觸抑制，細胞會停止分裂。8.如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細胞株和細胞系？細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞系多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質改變進行傳代培養(yǎng)時，懸浮培養(yǎng)的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，再用離心法收集，將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。9.如何解決接觸抑制的問題繼續(xù)擴大培養(yǎng)？進行傳代培養(yǎng)，原因是原代培養(yǎng)時會出現(xiàn)細胞貼壁和接觸抑制，細胞會停止分裂。11.研究細胞正常生理機制通常用傳代10代以內的細胞，為什么？10.動物細胞會不會一直傳代下去？在細胞繁殖過程中，一般只可以繁殖大10~50次，這些細胞稱作細胞株。在五十代之后細胞就會大量死亡，剩下可以無限繁殖的細胞，屬于癌變細胞，叫細胞系。動物細胞培養(yǎng)技術常將細胞培養(yǎng)至10代以內。培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至10～50代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質可能會發(fā)生突變，而10代以內的細胞一般能保持正常的二倍體核型。從首次傳代到傳至10代：容易傳代，傳代細胞正常的二倍體核型不會改變。

核型（染色體組型）：一個細胞內所有染色體的大小、形狀和數(shù)量特性的匯總。細胞傳至10-50代左右時：細胞增殖緩慢，以至于完全停止，此時部分細胞的細胞核型可能會發(fā)生變化。10-50代之后：如果繼續(xù)傳代培養(yǎng)，少部分細胞會克服細胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細胞已經發(fā)生了突變，正在朝著等同于癌細胞的方向發(fā)展。比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理細胞的全能性細胞增殖培養(yǎng)基性質固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--動物血清培養(yǎng)結果植物體細胞株、細胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動物的器官或組織其他條件無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件12.比較動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)技術的應用1.蛋白質生物制品的生產

酶、生長因子、疫苗、單克隆抗體等2.應用于基因工程

主要用于受體細胞3.檢測有毒物質，判斷某種物質的毒性

4.細胞的生理、藥理、病理研究

（許多致畸、致癌物質加入培養(yǎng)液后，培養(yǎng)細胞會發(fā)生染色體結構和數(shù)目的變異。根據(jù)變異細胞占全部培養(yǎng)細胞的百分數(shù)，可以判斷某種物質的毒性。）利用動物細胞培養(yǎng)技術，解決為燒傷病人植皮問題動物細胞培養(yǎng)要經過脫分化的過程嗎？為什么？動物細胞培養(yǎng)不需經過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。

干細胞（StemCells）是一類未分化的細胞或原始細胞，是具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定的條件下，干細胞可以分化成機體內的多功能細胞，形成任何類型的組織和器官，以實現(xiàn)機體內部建構和自我康復能力。干細胞工程是在細胞培養(yǎng)技術的基礎上發(fā)展起來的一項新的細胞工程。干細胞工程是利用干細胞的增殖特性，多分化潛能及其增殖分化的高度有序性，通過體外培養(yǎng)干細胞、誘導干細胞定向分化或利用轉基因技術處理干細胞以改變其特性的方法，以達到利用干細胞為人類服務的目的。干細胞培養(yǎng)及其應用什么是干細胞？是來自于胚胎、胎兒或成人體內具有在一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的一類細胞，能夠產生表現(xiàn)型與基因型和自己完全相同的子細胞，也能產生組成機體組織、器官的已特化的細胞，同時還能分化為祖細胞存在：存在于早期胚胎、骨髓和臍帶等多種組織和器官中。如：造血干細胞屬于成體干細胞，主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血中。分類：根據(jù)發(fā)育階段分為：胚胎干細胞（ES細胞）成體干細胞根據(jù)分化潛能分為：全能干細胞可分化成人體的各種細胞，從而組成各種組織和器官，最終發(fā)育成為一個完整的生物體（受精卵）。如：胚胎干細胞多能干細胞具有分化多種組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個體的能力。如：神經干細胞、造血干細胞專能干細胞由多能干細胞分化而來，只能向一種類型的細胞分化。如：肝臟干細胞、成肌細胞存在于早期胚胎中，具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。如：ES細胞可分化為心肌細胞、神經元、造血干細胞等。是成體組織或器官內的干細胞，包括骨髓中的造血干細胞、神經系統(tǒng)中的神經干細胞、睪丸中的精原干細胞等。特點：具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。有著自我更新能力和分化潛能的干細胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復等密切相關。成體干細胞成年動物的許多組織和器官，如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復和再生能力，成體干細胞起關鍵作用。在特定條件下，成體干細胞或者產生新的干細胞，或者按一定程序分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。造血干細胞是體內各種血細胞的唯一來源，主要存在于骨髓、外周血和臍帶血中。造血干細胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病及多發(fā)性轉移性腫瘤疾病的最有效方法。與骨髓移植和外周血干細胞移植相比，臍帶干細胞移植的長處在于無來源的限制，對HLA配型要求不高，不易受病毒或腫瘤的污染。通過有絲分裂，完成自我更新；在特定的生理條件下或實驗條件下，可以分化成其他類型的細胞。干細胞特征：干細胞主要用途：（1）通過造血干細胞的移植可以治療白血病、遺傳性血液病（如地中海貧血、血液再生障礙性貧血、鐮刀狀細胞貧血）等疾病。（2）自體器官移植

科學家正在研究用胚胎干細胞治療神經退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）、糖尿病、心肌壞死等疾病。（3）神經干細胞可治療神經組織損傷和神經系統(tǒng)退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）。（4）揭示細胞分化和細胞凋亡的機理。（5）用于對哺乳動物個體發(fā)生和發(fā)育規(guī)律的研究。胚胎干細胞：(1)形態(tài)上：(3)在體外培養(yǎng)的條件下，可以只增殖，而不分化。可以冷凍保存，也可以進行遺傳改造。(2)功能上：體積小、細胞核大、核仁明顯。具有發(fā)育的全能性,可分化為成年動物體內任何一種組織細胞。用于研究的胚胎干細胞的來源：

一是從自然胚胎中獲取；二是從通過細胞核移植技術克隆得到的胚胎中獲取（主要途徑）。

來源：由早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，簡稱ES或EK細胞。如：造血干細胞可來源于骨髓、外周血、臍帶血、胎兒造血系統(tǒng)和胚胎干細胞等。特點：（1）治療人類的某些頑癥。利用ES細胞可以誘導分化形成新的組織細胞的特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復并恢復正常功能。目前，在動物實驗方面，用ES細胞誘導分化出的某些組織細胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。主要用途（2）培育出人造組織器官，用于器官移植。隨著組織工程技術的發(fā)展，通過ES細胞體外誘導分化，還可以培育出人造組織