1.2.1微生物的選擇培養和計數

課前背誦：1.培養基的營養結構（P10）2.常用的消毒和滅菌方法（P10-11）3.倒平板步驟及注意事項（P12）4.平板劃線步驟及注意事項（P13）1.培養基凝固后倒置，分析原因2.平板劃線從第二次往后的每一次劃線均從上次末端開始，分析原因學習目標：1.運用生物與環境相適應的觀點來理解選擇培養的原理。（生命觀念）2.學會通過調整選擇培養基的配方來有目的地培養某種微生物。3.學習利用稀釋涂布平板法進行微生物的選擇培養。4.利用實驗分離并計數土壤中分解尿素的細菌，理解應用活菌計數方法。（科學研究）

自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優勢種群時，更難實現，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。該怎么辦？科學實例：尋找耐高溫的DNA聚合酶聚合酶鏈式反應（PCR）是一種在體外擴增DNA片段的技術，此項技術要求使用耐高溫的DNA聚合酶。1973年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發現了耐熱的水生棲熱菌，并從這種菌種提取出耐高溫的DNA聚合酶。篩選原因：水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。那么，如何從眾多的微生物中篩選出單一菌種？美國黃石公園根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。篩選原則耐寒微生物耐熱微生物石油分解菌有利于目的菌生長的條件有哪些？營養、溫度和pH等分離耐藥菌分離固氮菌分離自養型微生物選擇培養基：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，叫做選擇培養基。③不加含碳有機物的無碳培養基②不加氮源的無氮培養基①加入抗生素的培養基疑難突破一：選擇培養基分離固氮菌分離自養型微生物思考·討論選擇培養基配方的設計

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細菌分解成NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，脲酶催化尿素分解產生NH3，NH3可以作為細菌生長的氮源。討論：1.如果讓你配制一種培養基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方該如何設計？2.該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？

在選擇培養基中，以尿素作為唯一氮源，只有能合成脲酶的細菌才能生長發育繁殖

除以尿素作為唯一氮源外，該培養基的其他營養成分與普通培養基基本相同用設計好的選擇培養基，分離土壤中能分解尿素的細菌，并研究土壤樣品中含有多少這樣的細菌？閱讀課本19頁探究實踐，總結實驗流程：一、選擇培養基的制備二、對土壤樣品進行稀釋三、涂布平板操作四、培養并觀察培養基菌落五、計數土壤樣品中菌落數目

疑難突破二：選擇培養基的使用葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml①原理：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。1.選擇培養基的制備②配方：KH2PO4和Na2HPO4的作用是：①提供無機鹽；②調節pH。細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3-8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。2.稀釋土壤樣品（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1mL1ⅹ1090mL無菌水1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL9mL無菌水1mL②取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。（盡量滴盡酒精后灼燒）⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，培養3.稀釋涂布平板法的操作過程注意事項：1.在實驗操作中，每個步驟都要注意無菌操作，防止培養基污染。2.涂布器從酒精中取出時盡量讓多余酒精在燒杯中滴盡后再灼燒。且使用后不要將過熱的涂布器放入燒杯，以免引燃酒精。（涂布器能不能同接種環一樣直接在酒精燈上灼燒滅菌？）3.平板試管較多，做好清晰標記避免混淆。4.每一稀釋倍數的菌液至少涂布三個平板，作為重復實驗，計數時求平均。①不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30-37℃的溫度下培養1-2d。②每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。③一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。注意：設置對照組一同培養對照組：驗證是否有雜菌：未接種的選擇培養基驗證是否具有篩選作用：接種的牛肉膏蛋白胨培養基4.微生物的培養與觀察①原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過計數平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。選擇30-300個菌落的平板進行計數；每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；統計的結果一般用菌落數而不是活菌數；統計的菌落往往比活菌的實際數目低；恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。②計數原則因為當兩個或多個細胞連在一起時，繁殖后形成的還是一個菌落（1）間接計數法—稀釋涂布平板法5.微生物的數量測定如果得到了2個或2個以上菌落數目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數。不能區分死菌與活菌；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；（2）直接計數—計數板計數法①原理：利用細菌