免疫學補體參與反應細胞數(shù)量及其功能檢測第一頁，共二十二頁，2022年，8月28日PartI補體參與的反應

補體的溶血反應PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測

E花環(huán)形成試驗－－數(shù)量測定

淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：形態(tài)學方法

3H—TDR摻入法

MTT比色法

功能第二頁，共二十二頁，2022年，8月28日

補體激活的三條途徑經(jīng)典途徑MBL途徑旁路途徑IC+C1qMBL+病原體配基細菌+C3膜攻擊復合物細胞溶解PartI補體參與的反應復習第三頁，共二十二頁，2022年，8月28日1.補體的溶血反應

原理綿羊紅細胞（SRBC）作為抗原與其相應抗體（溶血素）結合后，通過經(jīng)典途徑激活補體，產(chǎn)生膜攻擊作用，最后導致紅細胞溶解，發(fā)生溶血反應。材料

1．抗原：2%綿羊紅細胞；

2．抗體(溶血素)；

3．補體：健康豚鼠新鮮血清

4．生理鹽水、24孔板等。

第四頁，共二十二頁，2022年，8月28日孔號SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－6滴33滴－3滴6滴43滴－－9滴

步驟1、取24孔板，按下表加入各成分；

2、將24孔板放在37℃溫箱內(nèi)15-30min，觀察并記錄結果。結果:第五頁，共二十二頁，2022年，8月28日PartIIT細胞數(shù)量及其功能檢測第六頁，共二十二頁，2022年，8月28日2.E花環(huán)形成試驗

原理人外周血T細胞表面具有天然的能與綿羊紅細胞(SRBC)表面糖肽相結合的受體－E受體（CD2分子），可結合SRBC形成花環(huán)樣細胞團，是T細胞特有的表面標志。

檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的細胞免疫狀況。第七頁，共二十二頁，2022年，8月28日材料肝素抗凝血、綿羊紅細胞(SRBC)淋巴細胞分層液、Hank’s液、1640培養(yǎng)液、0.5％戊二醛固定液、燦爛甲酚蘭染液試管、滴管、離心機、微量移液器、玻片、顯微鏡等第八頁，共二十二頁，2022年，8月28日

步驟：（動作輕柔；分清滴管及槍頭！！！）⑴取肝素抗凝血與等量Hank’s液稀釋混勻血3ml，用滴管貼管壁（傾斜30°）輕輕疊加于3ml分離液上（界面要清晰）→→→

配平后1800rpm離心13mins。

1.淋巴細胞懸液的制備：人淋巴細胞比重：1.070淋巴細胞分層液：1.077人紅細胞比重：1.092第九頁，共二十二頁，2022年，8月28日稀釋的血液

分層液離心前稀釋的血漿

單個核細胞分層液粒細胞紅細胞離心后第十頁，共二十二頁，2022年，8月28日第十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日⑵另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細胞，放入盛有5mlHank’s液的試管→→→2000rpm離心5mins。

(3)棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細胞輕彈混勻后加入Hank’s液5ml，重復離心兩次。2.棄去上清，留經(jīng)過洗滌的淋巴細胞懸液（約0.1ml）與綿羊紅細胞0.1ml

、1640營養(yǎng)液0.1ml混合（分清槍頭）→→→輕彈混勻后放于37℃溫箱15mins。＊離心時要配平第十二頁，共二十二頁，2022年，8月28日3.取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢，一啟動即關，來回數(shù)次即可）,室溫靜置2-3mins4.吸去100-150ul上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5.取一滴（25ul）液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。第十三頁，共二十二頁，2022年，8月28日6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴細胞上結合≥3個SRBC者為E花環(huán)陽性。正常參考值：EtRFC：64.4±6.7％；

EaRFC：23.6±3.5％；

EsRFC：3.3±2.6％第十四頁，共二十二頁，2022年，8月28日

結果T淋巴細胞SRBC第十五頁，共二十二頁，2022年，8月28日第十六頁，共二十二頁，2022年，8月28日淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗－－

原理

T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，稱淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機體的細胞免疫水平，故可作為測定機體免疫功能的指標。三種方法形態(tài)學方法、3H-TdR摻入法、MTT比色法第十七頁，共二十二頁，2022年，8月28日

根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構造與核仁的有無。成熟小淋巴細胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；過渡型淋巴細胞：大于小淋巴細胞、核染色比較疏松，胞漿比較多，但是出現(xiàn)核仁；淋巴母細胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁1－2個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細胞：中性粒細胞在培養(yǎng)72消失后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。形態(tài)學方法：〔鏡下觀察〕

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗第十八頁，共二十二頁，2022年，8月28日淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化的淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞×100％正常參考值：80％紅細胞未轉(zhuǎn)化淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗瑞氏染色10×40

第十九頁，共二十二頁，2022年，8月28日第二十頁，共二十二頁，2022年，8月28日3H—TDR摻入法

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗T細胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細胞進入S期，此時在細胞培養(yǎng)液中加入氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)，可以被細胞攝入而摻入DNA中，通過β-液體閃爍計數(shù)器測定3H-TDR的摻入量，判斷細胞的增殖程度。第二十一頁，共二十二頁，2022年，8月28日MTT比色法

－－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗