人絨毛膜促性腺激素檢測溯源問題劉奉亭青島蘭信醫學檢驗所，青島266100摘要目的：探討HCG檢測的溯源性及實驗間檢驗結果互相認可中存在的問題。方法：結合國際國內HCG檢測現狀，對有關HCG檢測的影響因素及國際標準物質方面的問題進行綜述。結果：HCG分子及其裂解產物種類繁多，抗原性相似又不完全相同，不同廠家試劑使用的抗體組合不同，對HCG類分子的識別不同。一些試劑的標簽不正確或不清楚，一些實驗人員對HCG檢驗的分子種類不清楚，國內HCG收費項目不全，是導致有意無意錯報檢驗項目的原因。目前發布的HCG國際標準物質含有雜質，并且對于無活性的a亞基和B亞基賦值錯誤。這些都給HCG檢測結果的實驗室間互相認可帶來困難。結論：HCG檢測的溯源及檢驗結果的實驗室間互相認可尚存在許多問題。要解決這些問題，需要新的、以摩爾濃度賦值的HCG國際標準的發布，各試劑廠商以新的國際標準物質作為抗原來制備抗體，并用新的抗體制備的HCG檢測試劑溯源到新的國際標準。另外，還要進一步普及有關HCG類分子及其裂解產物的知識宣傳。血清人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定對于妊娠的確認和監測，異位妊娠及其治療的監測，產前篩查，先兆流產、滋養層疾病、非滋養層腫瘤、生殖細胞瘤、膀胱癌、睪丸癌、肺癌等的診斷和治療效果的監測具有十分重要的意義if。人絨毛膜促性腺激素（HCG）與促黃體生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）及促甲狀腺激素（TSH）都是由一個a亞基和一個B亞基所組成⑻9］。這些激素都擁有共同的a亞基，它們的區別在B亞基［1。］。HCG的B亞基與FSH、TSH不同，但與LH的B亞基類似，LH的B亞基含有121個氨基酸，而HCG的B亞基含有145個氨基酸，在LH的B亞基的C末端延伸了24個氨基酸［11］。早期，人們采用生物學方法進行妊娠實驗，將尿液注入幼鼠等動物，通過觀察動物的反應而判斷是否懷孕。1960年Wide和Gemzell建立了首個妊娠實驗的免疫學方法一一紅細胞凝集法［12］。由于當時使用的是抗HCG血清，測定HCG時會受到LH、FSH和TSH等激素的干擾。1972年Vaitukaitis等使用抗HCGB亞基血清，建立了B-HCG的放射免疫測定法［13］。由于HCGB亞基與其它激素B亞基的區別，該測定方法與生理濃度的LH、FSH和TSH沒有顯著的交叉反應，可更為準確地反映標本中的HCG含量。隨著免疫檢測方法學的不斷改進，目前大多數醫學檢驗機構基本都使用（電）化學發光法對HCG進行全自動的檢測。HCG及其衍生物有很多種，來源與生理學功能各不相同。有常規HCGW16］、高度糖基化的HCGW16］、硫酸化的HCG［17,18］、游離a亞基［19,20］、高度糖基化的游離a亞基［19,20］、游離B亞基［21］、高度糖基化的游離B亞基［22-26］。在激素的產生、分泌、代謝等過程中，HCG分子會發生斷裂、解離等多種變化，從而在血、尿中以多種分子形式存在。目前已經發現有15種形式的HCGw（圖1）。所有的HCG類檢測試劑的定標品都使用可溯源至WHO的HCG標準。最早的WHO國際標準品（1938年和1964年）是HCG的粗制品。1978年這些國際標準品被高度純化的HCG制品一第一批國際參考制品所取代。這一標準品于1986作為第三批國際標準品、1999年作為第四批國際標準品發布。當今，所有的HCG類檢測試劑的定標品都可溯源至第三批或第四批國際標準品。由于這些標準品是從商品的孕婦尿液的粗提取物純化而來磔?］。而這些尿液都是在沒有溫度控制的條件下收集和儲存的，存在著HCG分子的解離和斷裂，純度也存在一定的問題。HCG測試方法使用的抗體也是針對這些尿液粗提取物純化的HCG及其亞基的［30］抗體。為解決HCG國際標準品不純等問題，2003-2005年WHO的IFCC工作組從人尿中純化了完整HCG、缺刻HCG、HCGB亞基、缺刻HCGB亞基、HCGa亞基、HCG6核心部分等6種形式的HCG,制備了6種國際參考物質（InternationalReferenceReagents）⑶1，分裝、凍干并以mol/L定值初。這些新制備的國際參考物質比第三批、第四批HCG國際標準品的純度有了很大的提高。2009年，Sturgeons等調查了使用不同的測定方法對這6種參考物質的測定結果,發現不同HCG測定方法在識別不同形式的HCG時有非常大的差異.他們調查的16種測試方法中，4種僅識別HCG,6種識別HCG及游離B亞基，6種識別HCG、HCGB和6核心部分。他們認為這些差異是導致測定HCG時，不同方法間差異的主要原因。Cao和Rej［34］將完整的HCG和游離B-HCG單一或組合加入到的無HCG血清基質中，制備出了含完整HCG、含hCGB和含完整HCG+hCGB的三種標本，連夜用冰塊降溫的方式分發到各個實驗室。各實驗室的檢測結果（表1）表

明，各種免疫學檢驗方法對完整HCG的識別尚可，對HCGB的識別存在很大差異，有一些試劑無法識別HCGB而導致測試結果接近于零。在對HCG+HCGB的測定Nickedhyp&rglyoosylatedhCGNickedregularHCGhCGFreeG-subunttmissingfiCTFOOOOOO0047/48NN47/4FNN47/48N47748NNickedhyperglycosylatedhCGmi骷府UCTPHypenglyecsytatedhGGfreeIS1450000Nickedhyp&rglyoosylatedhCGNickedregularHCGhCGFreeG-subunttmissingfiCTFOOOOOO0047/48NN47/4FNN47/48N47748NNickedhyperglycosylatedhCGmi骷府UCTPHypenglyecsytatedhGGfreeINickedhCGfreeB145^7/48NNickedhyperglycosylatedhCGfree值1450000000047/48NNNtckedhCGfreeG-sutiunilnrtissingfiCTP92RegularhCG145H/penglycosylaledhCGNichedregularhCG145NickedhyperglycosylatedhCGfreeilmissingfLCTF92l^-subunitcorefragment92Freeu-subunitO-glycosylatedfre&i^subunit47/4BNN0o47/40NNNOO圖1、妊娠及惡性疾病患者血清和尿中的15種HCG形式的結構圖數字為氨基酸編號，O代表與O聯接的寡糖，N代表與N聯接的寡糖，OO和NN代表大的即高度糖基化寡糖。a是a亞基，0是0亞基。0CTP是常規的或超糖基化的B亞基的C末端片段（93-145氨基酸殘基）。時，總BHCG測定的結果略高于完整HCG的測定結果。這可能是由于HCG試劑對HCGB識別不好，也可能是總BHCG試劑中的多種抗體對其中HCG的重復識別造成的。表1、多家實驗室采用不同方法對三種HCG標本測定的結果標本實驗室數試劑家數檢測項目E03E04E05總BHCG33.3-53.9<1-49.640-8323512完整HCG34-53.31-5035-77.2617注：E03含完整HCG約45IU/L,E04含hCGB約30IU/L,E05含完整HCG約40IU/L,hCGB約20IU/L。現行的HCG國際標準物質最初是為生物學方法而非免疫學方法制訂的，對于第三和第四批HCG及其亞基國際標準物質（IS）來說，70HCG約相當于650IU。對于沒有活性的a和B亞基，則人為給定單位，國際參考物質中每相當于一個國際單位M（表2）。這使得HCG及其亞基的單位并不等當。同樣的抗原抗體結合，反映在活性單位上，最大差別可達24倍（345/14）。另外，多種形式的HCG不同程度地與各種HCG抗體結合，都會給HCG的測定帶來一定的影響。表2.第三批HCG及其亞基國際標準各種單位的比較縮寫分子量Rg/IUIU/nmolHCG375000.11345HCGB23500123.5HCGa14000114目前，關于HCG類的測定的收費項目山東省只有HCG和特異B-HCG兩項即,特異B-HCG的收費遠遠高于HCG。市面上測定HCG的試劑主要有HCG、HCG+HCGB、總B-HCG、游離B-HCG等，并沒有什么特異B-HCG。由于廠家標簽的不清楚和概念混淆，加上一些HCG檢測種類沒有收費標準，目前許多醫院都把模棱兩可的HCG檢測項目按照特異B-HCG來報告。這就使得各醫療檢測機構測定的特異B-HCG不具有可比性。抗原抗體的結合應該以結合位點（mol）來計量，人為給定不等當的IU單位必將給測定結果帶來巨大的影響。由于生產廠商使用的抗體組成的特異性的差異及標準物質人為給定單位等原因，使用不同廠家試劑進行測定的結果會出現非常大的差異。例如采用羅氏公司HCG+B試劑和強生公司的總B-HCG試劑所進行的檢測，山東省內一般都報作特異B-HCG,其參考值在妊娠初期有著非常大的差別［36,37］（表3）。如果在進行妊娠監測或在一些疾病的治療效果監測時分別使用了這兩種不同的試劑，將可能會導致非常嚴重的錯誤結論。表3.強生總BHCG、羅氏HCG+B參考值比較強生羅氏孕周平均值范圍中位數范圍（5-95%）4505844700-132800111040-44805515173660-1340008050270-2870067267122600-135000297003700-8490078794344800-148600588009700-120000810348652600-1918007950031100-184000910378357400-1960009150061200-152000108825051000-1894007100022000-143000綜上所述，HCG測定的溯源及檢驗結果的實驗室間互相認可還存在許多問題。HCG與LH、FSH、TSH等具有相同的a亞基，與LH具有類似的B亞基；HCG具有眾多的變異體。HCG及其變異體具有廣泛而不同的功能,對于HCG及其變異體的測定具有眾多的臨床應用。現行的HCG國際標準品存在部分裂解和雜質，且在無活性亞基的賦值方面存在問題。由于廠家標簽不清楚、檢驗人員知識不足、收費項目名稱等原因錯報HCG類檢驗項目的事情經常發生。由于抗體特異性等問題，不同廠家的試劑測定HCG類物質的結果差異很大。如果新的HCG國際參考物質作為以摩爾濃度定標的國際標準品發布以后，各試劑廠商以此標準品免疫動物制備相應的HCG抗體，并以此抗體生產相應的HCG檢測試劑，同時使試劑的標準品溯源至新的國際標準品以后，將會在某種程度上降低不同廠家試劑間的差異。當然，要進一步改善HCG檢測的不同實驗室間互相認可，還要普及HCG類物質方面知識的宣傳。參考文獻1、Ulf-HkanStenmanl,AilaTiitinen,HenrikAlfthanlandLeenaValmul.Theclassification,functionsandclinicaluseofdifferentisoformsofHCG.HumanReproductionUpdate,Vol.12,No.6pp.769-784,2006。2、李貴容，王弓力.hCG在異位妊娠診斷和治療中的價值［J］實用婦科與產科雜志，1989,（5）3、葉國玲，廖世秀，趙曉嵐等.妊娠中期聯合檢測母血清AFP、B—HCG和uE_3篩查胎兒異常的可能性［J］西安醫科大學學報（中文版），1995,（4）4、吳國振，鐘園園，吳花葵.507例先兆流產B—HCGRIA檢測結果分析[J]現代診斷與治療，1995,(4)5、MoraJ,GasconN,TaberneroJM,etalDifferenthCGassaystomeasureectopichCGsecretioninbladdercarcinomapatients.BrJCancer.1996Oct;74(7):1081-4.6、RaghavanD,PeckhamMJ,HeydermanE,PrognosticfactorsinclinicalstageInon-seminomatousgerm-celltumoursofthetestis.BrJCancer.1982Feb;45(2):167-73.BurtRW,RatcliffeJG,StackBH,etalSerumbiochemicalmarkersinlungcancer.BrJCancer.1978May;37(5):714-717.8、Morgan,F,Canfield,RC,NatureoftheSubunitsofHumanChorionicGonadotropin.Endocrinology,1971,88(4):1045-1053,9、HertzR,OdellWDandRossGT,Diagnosticimplicationsofprimaryamenorrhea.AnnInternMed.1966,65(4):800-820.10、PierceJG,BahlOP,CornellJS,etalBiologicallyactivehormonespreparedbyrecombinationofthealphachainofhumanchorionicgonadotropinandthehormone-specificchainofbovinethyrotropinorofbovineluteinizinghormone.JBiolChem.1971,246(7):2321-2324.11、PierceJG,ParsonsTF(1981)Glycoproteinhormones:structureandfunction.AnnuRevBiochem50:465-495.WideL,GemzellCAAnimmunologicalpregnancytest.ActaEndocrinol(Copenh)1960,35:261-267VaitukaitisJL,BraunsteinGDandRossGTAradioimmunoassaywhichspecificallymeasureshumanchorionicgonadotropininthepresenceofhumanluteinizinghormone.AmericanJournalofObstetricsandGynecology,1972,113:751-758.14、HoshinaM,BoimeI,MochizukiM.CytologicallocalizationofhPL,hCG,andmRNAinchorionictissueusinginsituhybridization.ActaObstetGynaecolJaponica.1984;36:397-404.15、HandschuhK,GuibourdencheJ,TsatsarisV,etalHumanchorionicgonadotropinproducedbytheinvasivetrophoblastbutnotthevilloustrophoblastpromotescellinvasionandisdown-regulatedbyperoxisomeproliferator-activatedreceptor-a.Endocrinol.2007;148:5011-5019.doi:10.1210/en.2007-0286.KovalevskayaG,GenbacevO,FisherSJ,etalTrophoblastoriginofhCGisoforms:cytotrophoblastsaretheprimarysourceofchoriocarcinoma-likehCG.MolCellularEndocrinol.2002;194:147-155.17、ColeLA,LadnerDG.BackgroundhCGinNon-PregnantIndividuals:NeedforMoreSensitivePoint-of-CareandOver-the-CounterPregnancyTests.ClinBiochem.2009;42:168-175.18、ColeLA.In:Humanchorionicgonadotropin(hCG)ColeLA,editor.Elsevier,Oxford;2010.BackgroundhCG.19、BlitheDL,NisulaBC.Variationsintheoligosaccharidesonfreeandcombinedalpha-subunitsofhumanchoriogo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