生物化學(xué)實驗

武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院任課教師：

劉軍閆達(dá)中曾萬勇董國清丁洪波實驗?zāi)夸泴嶒?淀粉的測定—1％鹽酸旋光法實驗2甲醛滴定法測定氨基氮含量實驗3

蛋白質(zhì)含量測定—雙縮脲法實驗4

油脂皂化與皂化值的測定實驗5溫度對酶活性的影響實驗6血紅蛋白的凝膠過濾實驗7DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗8綜合性實驗羧甲基纖維素酶活力及pH值對酶活力影響實驗9PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品大豆、玉米實驗1

淀粉的測定—1％鹽酸旋光法一、目的與要求

掌握旋光法測粗淀粉的基本原理;掌握旋光儀的使用方法。二、原理

在加熱及稀鹽酸的作用下，淀粉水解并轉(zhuǎn)入鹽酸溶液中。在一定的水解條件下，一種谷物淀粉具有一種特定的比旋光度。因此可用旋光法測定粗淀粉的含量。1、旋光儀

從光源(1)射出的光線，通過聚光鏡(3)、濾色鏡(4)經(jīng)起偏鏡(5)成為平面偏振光，在半波片(6)處產(chǎn)生三分視場。通過檢偏鏡(8)及物、目鏡組(9)可以觀察到如圖所示的三種情況。轉(zhuǎn)動檢偏鏡，只有在零度時（儀器出廠前調(diào)整好）視場中三部分亮度一致（如下圖）。

a.大于（或小于）零度的視場

b.零度視場

c.小于（或大于）零度視場2、使用方法(1)將儀器接于220V交流電源。開啟電源開關(guān)，約5分鐘后鈉光燈發(fā)光正常，就可開始工作。(2)檢查儀器零位是否準(zhǔn)確，即在儀器未放試管或放進(jìn)充滿蒸餾水的試管時，觀察零度時視場亮度是否一致。如不一致，說明有零位誤差，應(yīng)在測量讀數(shù)中減去或加上該偏差值。或放松度盤蓋背面四只螺釘，微微轉(zhuǎn)動度盤蓋校正之（只能校正0.5°左右的誤差，嚴(yán)重的應(yīng)送制造廠檢修）。三、操作方法

1.樣品制備

稱取粉碎過40目篩的（玉米）樣品2.50g（精確至0.01g）放入100mL錐形瓶中；沿器壁緩慢加入50mLl％的鹽酸溶液，并輕輕搖動使全部樣品潤濕；將錐形瓶放入沸水浴中，預(yù)熱3min，在沸水中準(zhǔn)確加熱15min；立即取出，迅速冷卻至室溫。2．樣品測定

先加1mL30％的硫酸鋅溶液，充分混勻；再加入1mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻并全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用少量蒸餾水將錐形瓶沖洗幾次；若泡沫過多，加幾滴無水乙醇消泡；用蒸餾水定容至刻度；混勻后過濾，棄去初始濾液15mL，收集其余濾液充分混勻；進(jìn)行旋光測定。式中α—測得的旋光度；[α]—淀粉的比旋光度（見下表）

l—旋光管長度（dm）；

m—樣品質(zhì)量（g）

四、結(jié)果處理說明：（1）實驗中，沸水浴要備有足量的水；要用定時鐘準(zhǔn)確記時。（2）提前打開旋光儀，使其進(jìn)入穩(wěn)定的工作狀態(tài)。五、思考題

樣品加鹽酸處理時，煮沸時間少于或多于15min會對測定結(jié)果分別產(chǎn)生什么影響？實驗2

甲醛滴定法測定氨基氮含量

一、目的與要求（1）掌握蛋白質(zhì)氨基酸含量的甲醛滴定法測定原理。（2）熟悉滴定操作的要點。二、原理

氨基酸是兩性電解質(zhì)，在水溶液中有如下電離平衡：

-NH3+是弱酸，完全解離時pH為11～12或更高，若用堿滴定所釋放的H+來測量氨基酸，一般指示劑變色域小于10，很難準(zhǔn)確指示終點。常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基化合物，使上述平衡右移，促使-NH3+釋放H+，使溶液的酸度增加，滴定終點移至酚酞的變色范圍內(nèi)（pH9.0左右）。因此，可用酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定。如樣品為一種已知的氨基酸，從甲醛滴定的結(jié)果可算出氨基氮的含量。如樣品是多種氨基酸的混合物如蛋白水解液，則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)。此法簡便快捷，常用來測定蛋白質(zhì)的水解程度，隨水解程度的增加滴定值增加，滴定值不再增加時，表示水解作用已完全。三、操作方法

取3個25mL的錐形瓶，編號；向第1、2號瓶內(nèi)各加入0.1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液2mL和水5mL，混勻；向3號瓶內(nèi)加入7mL水。然后向三個瓶中各加入5滴酚酞指示劑，混勻后各加2mL甲醛溶液再混勻；分別用0.1mol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的溶液滴定至溶液顯微紅色重復(fù)以上實驗3次，記錄每次每瓶消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)。取平均值,用于計算甘氨酸氨基氮的回收率。取未知濃度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法進(jìn)行測定，平行三次，取平均值,用于計算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克數(shù)。四、結(jié)果

甘氨酸氨基氮的回收率：

公式中實際測得量為滴定第1和2號瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)。取平均值與第3號瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液毫升數(shù)之差乘以標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的摩爾濃度，再乘以14.008。2mL乘以標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸的摩爾濃度再乘以14.008即為加入理論量的毫克數(shù)。每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克數(shù):V1為滴定待測液耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)

V2為滴定對照液（3號瓶）耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)。

CNaOH為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度。

五、思考題

1、甲醛法測定氨基酸含量的原理是什么?2、為什么氫氧化鈉溶液滴定氨基酸的-NH3+基上的H+，不能用一般的酸堿指示劑？實驗3

蛋白質(zhì)含量測定—雙縮脲法一、目的與要求

掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。復(fù)習(xí)鞏固7200型分光光度計的操作，并了解其基本結(jié)構(gòu)。二、實驗原理

蛋白質(zhì)分子中含有多個與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的酰胺鍵，也具有這一反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物在540nm處有最大光吸收顏色的深淺與蛋白質(zhì)（或多肽）的濃度呈正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的種類無關(guān)因而，雙縮脲反應(yīng)可用測定蛋白質(zhì)的含量。在一定的實驗條件下，將未知濃度的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白質(zhì)溶液同時與堿性硫酸銅反應(yīng)，并于540nm處比色，可通過標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出未知樣品蛋白質(zhì)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)濃度的蛋白質(zhì)溶液可由結(jié)晶的牛血清清蛋白，卵清蛋白或酪蛋白粉配制。除-CONH-有此反應(yīng)外,-CH2NH2，-CONH2,-CSNH2等基團(tuán)亦有此反應(yīng)，故應(yīng)注意有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。三、操作方法

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試劑管號空白管12345

測定管蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（5mg/mL）/mL待測樣品/mL雙蒸水/mL雙縮脲試劑/mL

00.40.81.21.62.0121.61.20.80.401

4444444

搖勻，37℃保溫30min，在540nm處比色，測定吸光度值（二）樣品蛋白質(zhì)濃度的測定待測樣品必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專姑亢辽泻?.5mg左右的蛋白質(zhì)，才能進(jìn)行測定。該過程至少重復(fù)兩次或平行測定兩次。7200分光光度計的使用四、結(jié)果處理

固體樣品中蛋白質(zhì)含量＝m’×Vm/Vn×1/m×10-3×100%式中m′——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的樣品的蛋白質(zhì)含量（mg）Vn——用于顯色的樣品體積（ml）Vm——樣品稀釋后的體積（ml）m——樣品的質(zhì)量（g）說明：(1)雙縮脲測定蛋白質(zhì)含量的方法操作簡便迅速，不需要昂貴的儀器和試劑，適合一般實驗室的要求，因而被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和科研中。(2)作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)用凱式定氮法測定純度，否則誤差較大。(3)該反應(yīng)在常溫下也可顯色，于37度下30分鐘后顏色趨于穩(wěn)定。(4)當(dāng)肽中含有脯氨酸時，若糖類較多，則顯色反應(yīng)不好，測定值偏低。(5)雙縮脲試劑還常用來檢測蛋白質(zhì)的水解是否完全。五、思考題

（1）對于作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)應(yīng)有何要求？（2）若何選擇未知樣品的用量？（3）如何操作和處理數(shù)據(jù)才能減小試驗誤差？（4）若為液體樣品，如何求其濃度？實驗4

油脂皂化與皂化值的測定

一、目的與要求

掌握皂化原理測定皂化值的方法。二、原理

脂肪的堿水解稱為皂化作用；KOH有助于脂肪的水解，并與釋放的脂肪酸中和，形成肥皂；中和1g脂肪完全水解所釋放的脂肪酸所需要的KOH毫克數(shù)即為皂化值；它的實踐意義是：組成脂肪的脂肪酸碳鏈越長，每克脂肪水解所釋放的脂肪酸越少，即皂化值越小。也就是說皂化值與脂肪、脂肪酸的相對分子質(zhì)量成反比。制皂工業(yè)中利用這一數(shù)值來確定皂化所需堿量。三、操作方法

1.稱樣

在分析天平上準(zhǔn)確稱取兩份質(zhì)量為1g的油（或脂），置于250mL錐形瓶中。2.皂化在樣品瓶和空白瓶（不加油或脂）中各加0.5mol/LKOH乙醇溶液25mL，再加幾個玻璃珠，裝上回流管，在水浴上回流30min左右，至瓶內(nèi)液體澄清并無油珠為止。3.滴定皂化完畢后，冷卻至室溫，取下錐形瓶，分別加入1%的酚酞指示劑2～3滴，然后以0.5mol/L的HCl滴定至終點，記錄HCl用量。四、結(jié)果處理

皂化值=

式中VA—空白瓶鹽酸用量（mL）；VB—樣品瓶鹽酸用量（mL）；m—油脂的質(zhì)量（g）。

五、思考題

1.上式中（VA-VB）的含義是什么?2.試列出由皂化值計算油脂相對分子質(zhì)量的公式。實驗5

溫度對酶活性的影響

一、目的與要求

（1）了解溫度對酶活性的影響。（2）掌握試驗溫度對酶活性影響的原理及方法。二、原理

酶的催化活性受溫度的影響很大，溫度對酶催化的反應(yīng)有雙重效應(yīng)，一方面，溫度上可以使加快；另一方面，溫度升高又可使酶因變性而失活。本實驗以枯草桿菌α-淀粉酶和蔗糖酶為例，說明溫度對酶活性的影響。三、操作方法

（1）溫度對α-淀粉酶活性的影響取3支試管，編號，各加入0.5％可溶性淀粉溶液3mL，分別置于冰水浴，37℃水浴及沸水浴中，保溫5min，各緩緩加入1mLα-淀粉酶稀釋液（試管勿從水浴中取出）繼續(xù)保溫5min，取出37℃水浴及沸水浴中試管置于冰水浴中冷卻后，各加入碘—碘化鉀溶液約1mL，比較各管顏色，并解釋之。（2）溫度對蔗糖酶活性的影響取3支試管，編號，各加入2％蔗糖溶液3mL，分別置于冰水浴，37℃水浴及沸水浴中，保溫5min后，各加入1mL蔗糖酶液，繼續(xù)保溫10min，取出后各加入2mL本氏試劑，置于沸水浴中煮2min。比較各管顏色，并解釋之。四、思考題

（1）溫度對酶活性的影響的機(jī)理。（2）試驗溫度對酶活性影響的一般方法。（3）如果要定量測定溫度對酶活性影響，實驗方案如何設(shè)計？實驗6

血紅蛋白的凝膠過濾

一、目的與要求

學(xué)習(xí)并掌握凝膠過濾的基本操作技術(shù)、分離原理及其應(yīng)用。二、原理

凝膠過濾(Gelfiltration)色譜，又稱分子篩色譜(MolecularSievehromatography)或排阻色譜(Exclusionhromatography)。凝膠過濾色譜所用的介質(zhì)載體由具有一定孔徑的多孔親水性凝膠顆粒組成。當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時，如圖7所示，直徑大于孔徑的分子將不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，便直接沿凝膠顆粒的間隙流出，稱為全排出。

較小的分子則容納它的空隙內(nèi)，自由出入，造成在柱內(nèi)保留時間長。這樣，較大的分子先被洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達(dá)到相互分離的目的。洗脫時峰的位置和該物質(zhì)相對分子質(zhì)量有直接的定量關(guān)系。在一根凝膠柱中，顆粒間自由空間所含溶液的體積稱為外水體積Vo，不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為V0時，出現(xiàn)洗脫峰。圖

凝膠色譜原理

圖

凝膠色譜中洗脫的三種峰凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積稱為內(nèi)水體積Vi，能全部透入凝膠的那些小分子，當(dāng)洗脫體積為Vo+Vi時出現(xiàn)洗脫峰，介于其間的分子將在洗脫體積為Vo+Ve時，出現(xiàn)洗脫峰(圖30-2)。由于凝膠過濾具有設(shè)備簡單、操作條件溫和，分離效果好，重現(xiàn)性強(qiáng)、凝膠柱可反復(fù)使用等優(yōu)點，所以被廣泛地使用于蛋白質(zhì)等大分子的分離純化、分子量測定、濃縮、脫鹽等操作中。三、操作方法

1.凝膠溶脹取5gSephadexG-25，加200mL蒸餾水充分溶脹(在室溫下約需6h或在沸水浴中溶脹5h)。待溶脹平衡后，用傾瀉法除去細(xì)小顆粒，在真空干燥器中減壓除氣，準(zhǔn)備裝柱。2.裝柱將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，把處理好的凝膠連同適當(dāng)體積的蒸餾水用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入柱中。最好一次連續(xù)裝完所需的凝膠，若分次裝入，需用玻棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面影響分離效果。裝柱后形成的凝膠床至少長8cm，最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的濾紙片保護(hù)凝膠床面。注意：整個操作過程中凝膠必須處于溶液中，不得暴露于空氣，否則將出現(xiàn)氣泡和斷層，應(yīng)當(dāng)重新裝柱。3.平衡用蒸餾水洗脫，調(diào)整流量，使膠床表面保持2cm液層，平衡20min。4.樣品制備取2mL抗凝血放入試管中，加入等體積的銅鹽溶液，混勻待用。5.上樣當(dāng)膠床表面僅留約1mm液層時，吸取0.5mL血紅蛋白與銅鹽混合樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央，注意切勿沖動膠床，慢慢打開螺旋夾，待大部分樣品進(jìn)入膠床、床面上僅有1mm液層時，用乳頭滴管加入少量蒸餾水，使剩余樣品進(jìn)入膠床，然后用滴管小心加入3～5cm高的洗脫蒸餾水。6.洗脫繼續(xù)用蒸餾水洗脫，調(diào)整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。觀察并記錄實驗現(xiàn)象。最后用洗脫液把柱內(nèi)有色物質(zhì)洗脫干凈，保留凝膠柱重復(fù)使用或回收凝膠。四、結(jié)果

描述并解釋實驗現(xiàn)象，討論凝膠過濾的效果。五、思考題

1.凝膠過濾又稱為分子篩，大小不同的分子經(jīng)過凝膠過濾被洗脫出來的次序與一般普通過濾有什么不同？為什么？2.凝膠過濾在生物化學(xué)實驗研究中有哪些用途？實驗7

DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、目的與要求

掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法和原理二、原理凝膠電泳是分離與測定生物大分子的一項重要技術(shù)，瓊脂糖糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定及純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡單、快速，可以分辨用其他方法不能分辨的DNA片段。DNA溶液在pH8.0時帶負(fù)電，在電泳電場中向正極移動，用聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5～500bp）效果最好，其分辨力極高，相差1bp的DNA片段都能分開。瓊脂糖凝膠的分辨能力雖低，但其分離的范圍較廣，可以分離長度為200bp～50000bp的DNA。

本實驗采用的是瓊脂糖凝膠電泳，它常用于按分子量大小分離DNA片段，小片段比大片段遷移快，在不同濃度的凝膠上，DNA片段遷移的速度也不相同，凝膠濃度越大，凝膠的纖維網(wǎng)孔越密，越能有效地分離不同分子量的分子，尤其是分離小分子質(zhì)量的分子。利用溴酚藍(lán)染色劑可以判斷電泳遷移距離，電泳時間不能過長，否則遷移速度快的小分子量的DNA片段會跑到緩沖液中去。觀察瓊脂糖凝膠中的DNA片段最簡便的方法是利用熒光染料溴化乙錠（或其替代品GoldView）進(jìn)行染色，溴化乙錠可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團(tuán)，從而與DNA結(jié)合，并呈現(xiàn)熒光，顯示出不同分子量的DNA帶圖譜，用已知大小的標(biāo)準(zhǔn)樣品與未知片段的遷移距離相比較，就可以決定未知DNA分子量大小。三、操作步驟（一）瓊脂糖凝膠板的制備：1．瓊脂糖凝膠的制備

稱取0.3g瓊脂糖于100mL燒杯中,加入30mLTBE緩沖溶液,在電爐上加熱溶解，待完全融化后放置室溫冷卻至60℃左右。加入3μlGoldView，混勻。2．板的制備

將上述冷卻至60℃左右的瓊脂糖凝膠溶液倒入水平放置的制膠模具中，放上梳齒。待膠凝固后取出梳齒，將膠板放入電泳槽中，膠面應(yīng)浸沒在TBE緩沖液液面以下2~3mm。

將冷卻至65℃的瓊脂糖凝膠液小心地倒進(jìn)有機(jī)玻璃內(nèi)槽，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。在室溫下靜置lh，待凝固完全后，取下橡皮膏，將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在電泳槽中，倒入TBE稀釋緩沖溶液，直至浸沒過膠面2～3mm。雙手輕輕地且用力均勻地拔出樣品槽模板，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。（二）加樣用微量加樣器按下表配制樣品與標(biāo)準(zhǔn)，混合后加樣。孔1（泳道1）孔2（泳道2）分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）/μl50DNA樣品/μl05點樣液/μl01（三）電泳加完樣品后的凝膠板立即通電，于150v電壓下電泳20~30min。在低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系，但是，在電場強(qiáng)度增加時，不同分子量的DNA片段泳動速度的增加是有區(qū)別的，因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm。電泳溫度視需要而定，對大分子的分離，以低溫為好，也可在室溫下進(jìn)行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5％時，由于膠太稀，最好在4℃下進(jìn)行電泳，以增加凝膠硬度。（四）觀察和拍照在波長為254nm的紫外燈下，觀察染色后的電泳凝膠。存在DNA的地方顯示出紅色的熒光條帶。用紫外光激發(fā)30S左右，肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光的損傷。拍照電泳圖譜時，采用透射紫外光，照相機(jī)鏡頭加近攝接圈和紅色濾光片（580～600nm），距離50～60cm，采用全色膠卷，光圈為5.6，曝光時間10～20S，可根據(jù)熒光條帶的深淺進(jìn)行選擇。將電泳圖譜放大為0.9cm×1.5cm的照片，用于相對分子質(zhì)量的測定。以上步驟可以用凝膠自動成像儀處理代替。四、實驗結(jié)果

根據(jù)電泳結(jié)果，繪制DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是在放大的電泳照片上，用卡尺量出λDNA的EcoRI或HindⅢ酶解各片段的遷移距離，以厘米為單位。以λDNA酶解各片段的相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以它們的遷移距離為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出連接各點的曲線，即為測定DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。五、注意事項1．DNA分子的大小與電泳遷移率的關(guān)系DNA分子通過瓊脂糖凝膠的速度（電泳遷移率）與其分子量的常用對數(shù)成反比。2．瓊脂糖的濃度與電泳遷移率的關(guān)系一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。因此，要有效地分離大小不同的DNA片段，選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度是非常重要的，可參看下表。瓊脂糖凝膠濃度與DNA片段大小的關(guān)系瓊脂糖凝膠濃度/％DNA片段的大小/kb0.35～600.61～210.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～33．瓊脂糖濃度與電壓的關(guān)系

研究瓊脂糖凝膠電泳分離大分子DNA的條件時發(fā)現(xiàn)，低濃度和低電壓時的分離效果較好。膠的濃度越低，適于分離的DNA分子越大，這是一個總的規(guī)律，如果濃度太低，制膠則有困難，且電泳結(jié)束后將膠取出時也有困難。在低電壓情況下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比，但是如果電壓增高，電泳分辨力反而下降。因為電壓升高了，樣品流動速度增快，大分子在高速流動時，分子伸展開來，使摩擦力增加，這樣相對分子質(zhì)量與移動速度就不一定呈線性關(guān)系了。4.核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，DNA的電泳速度次序如下：共價閉合環(huán)DNA＞直鏈DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。但當(dāng)瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0（mR=0），而同樣大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前進(jìn)（mR＞0）。由此可見，構(gòu)型不同，在凝膠中的電泳速度差別較大，RNA也同樣如此。

六、思考題

做好本實驗的關(guān)鍵是什么？實驗8綜合性實驗羧甲基纖維素酶活力及pH值對酶活力影響一、實驗?zāi)康耐ㄟ^設(shè)計，學(xué)習(xí)并了解化學(xué)類實驗的基本過程與基本方法，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力，養(yǎng)成科學(xué)實驗的良好習(xí)慣。學(xué)習(xí)并了解羧甲基纖維素酶的基本特性，學(xué)習(xí)酶的抽提、最適pH的測定及酶活力測定的方法。學(xué)習(xí)還原糖的測定、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及分光光度計的使用方法。學(xué)習(xí)試劑的配制，學(xué)習(xí)方案的制定與調(diào)整、數(shù)據(jù)的處理及實驗報告撰寫二、實驗原理纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖。無論一年生或多年生植物，尤其是各種木材都含布大量的纖維素。植物體內(nèi)約有50％的碳以纖維素的形式存在。估計地球上綠色植物每年大約凈產(chǎn)有機(jī)物15-20×1010噸，其中纖維素占三分之一至二分之一。棉花、亞麻、芋麻和黃麻部含有大量優(yōu)質(zhì)的纖維素。木材中的纖維素則常與半纖維素和木質(zhì)素共同存在。纖維素中單糖以β-1，4-糖苷鍵連接成為長鏈多糖1950年Reese提出了C1-Cx概念。

C1——水解因子，作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)（如棉花纖維即為高度結(jié)晶性纖維），使氫鍵破裂，呈無定形可溶態(tài)，成為長鏈纖維素分子。（本實驗以棉球為材料)

Cx通常包括：

（1）內(nèi)切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，簡稱EG)。這類酶隨機(jī)水解β-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短。

（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又稱纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase，簡稱CBH）。這類酶作用于β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子。

（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，簡稱BG），這類酶將纖維二糖（水楊素即為葡萄糖苷鍵連接的纖維二糖）水解成葡萄糖分子。

三、實驗要求根據(jù)相關(guān)資料，提出實驗方案修訂實驗方案實驗實施數(shù)據(jù)處理與實驗報告四、基本實驗過程提出實驗設(shè)計制作還原糖—吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定pH對纖維素酶活力的影響曲線及該酶的最適pH值；測定不同底物時的纖維素酶活力。(C1活力單位\Cx活力單位\Cb活力單位)五、材料、試劑與儀器材料：定性試紙、脫脂棉球試劑：0.1mol/L乙酸溶液、0.1mol/L乙酸鈉緩沖溶液、DNS顯色劑、1%CMC溶液、水楊素、0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、纖維素酶溶液儀器：水浴鍋(恒溫，50±0.5℃)、722型分光光度計、玻璃制品、冰箱、熱干燥箱（80±1℃），分析天平（感量0.1㎎）六、注意事項遵守實驗室制度，注意操作安全保持實驗室整潔，愛護(hù)儀器設(shè)施不懂就請教老師，規(guī)范化操作節(jié)約試劑實驗9PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品大豆、玉米一、目的與要求

學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)基因食品檢測的原理和方法二、原理

為了檢測常見大豆、玉米樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，可以通過PCR法檢測待測樣品基因組中是否含有目前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物通用啟動子、終止子等序列。本實驗采用改進(jìn)的CTAB法提取大豆、玉米基因組DNA，應(yīng)用PCR檢測方法，以大豆凝集素(Lectin)基因為內(nèi)參，花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S啟動子)、農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)及外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)為靶基因檢測大豆中的轉(zhuǎn)基因成分。三、試劑、儀器(一)儀器凝膠成像分析系統(tǒng)，恒溫水浴鍋，臺式高速離心PCR擴(kuò)增儀，電泳儀(二)試劑(1)Tris-HCl(1mol/LpH8.0)(2)0.5mol/LpH8.0EDTA1.86gNa-EDTA·2H2O加20mL水，用固體氫氧化鈉節(jié)pH至8.0，定溶至10mL。(3)CTAB緩沖液10mLTris-HCl(1mol/LpH8.0)；5mLEDTA(0.5mol/L(pH8.0)；2.0g十六烷基溴化(CTAB)；8.2gNaCl,定容至100mL。120℃滅菌30min。

(4)CTAB沉淀液0.5gCTAB；2.3376gNaCl；定容至100mL。120℃菌30min。(5)氯仿：異戊醇(24：1)氯仿48mL、異戊醇2mL。(6)NaCl(1.2mol/L)7.02gNaCl定容至100mL。120℃滅菌30min。(7)TaKaRaTaqDNApolymerase(8)PCR引物大豆Lectinp1：5’-gccctctactccacccccatcc-3’p2：5’-gcccatctgcaagcctttttgtg-3’玉米IVR

p3：5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-3’p4：5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-3’CaMV35Sp5：5’-gatagtgggattgtgcgtca-3’p6：5’-gctcctacaaatgccatca-3’NOSp7：5’-gaatcctgttgccggtcttg-3’p8：5’-ttatcctagtttgcgcggta-3’CP4EPSPSp9：5’-c