實(shí)驗(yàn)二熒光光譜法一、概述1.1.分子發(fā)光分析法及其分類某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光。在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法為分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過(guò)程中以光輻射形式釋放能量根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類：光致發(fā)光：以光源來(lái)激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來(lái)激發(fā)而發(fā)光—原子發(fā)射光譜法生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法1.2.分子熒光分析法的特點(diǎn)靈敏度高

檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)范圍10-8~10-10g/mL選擇性好熒光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，比較容易排除其它物質(zhì)的干擾實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單待測(cè)樣品用量少二、熒光光譜法的基本原理2.1分子熒光的產(chǎn)生基態(tài)單重態(tài)S0第一激發(fā)單重態(tài)S1*第一激發(fā)三重態(tài)T1*禁阻躍遷允許躍遷Pauli不相容原理：分子中同一軌道所占據(jù)的兩個(gè)電子必須具有相反的自旋方向，即自旋配對(duì)。電子激發(fā)的多重態(tài)：M=2s+1單重態(tài):分子中全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)的,s=0,M=1三重態(tài)：電子在躍遷過(guò)程中還伴隨著自旋方向的改變，s=1,M=32.1.1分子能級(jí)與電子能級(jí)的多重性2.1.2分子熒光的產(chǎn)生分子室溫時(shí)處于電子能級(jí)的基態(tài)，當(dāng)吸收光輻射后基態(tài)分子中電子只能躍遷激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，根據(jù)自旋禁阻選律，不能直接躍遷到激發(fā)三重態(tài)各能級(jí)。處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，通常以輻射躍遷和無(wú)輻射躍遷釋放多余的能量而返回到基態(tài)，發(fā)射熒光是其中一條途徑。第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ22.2.1

振動(dòng)弛豫（vibrationalrelexation)：從電子激發(fā)態(tài)的某一振動(dòng)能級(jí)到達(dá)同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。特點(diǎn)：發(fā)生在同一個(gè)激發(fā)態(tài)的電子能級(jí)上；時(shí)間約10-12秒。2.2分子發(fā)光的產(chǎn)生第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ2第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ22.2.2內(nèi)轉(zhuǎn)換（internalconversion)：當(dāng)兩個(gè)電子的能級(jí)非?？拷灾缕湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，電子常常由高能級(jí)以非輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)，這種過(guò)程也稱為內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換。特點(diǎn)：兩個(gè)電子的能級(jí)非常靠近以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)內(nèi)部轉(zhuǎn)換易發(fā)生；10-13~10-1秒可完成。第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ22.2.3外部能量轉(zhuǎn)換（externalconversion)：在溶液中激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子之間或其他分子的碰撞而失去能量，常以熱能的方式放出，這個(gè)過(guò)程也稱為外轉(zhuǎn)換。特點(diǎn)：發(fā)生在分子與分子的碰撞時(shí)；時(shí)間約10-9~10-7秒。第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ22.2.4系間跨越（intersystemcrossing)：處于受激分子的電子在激發(fā)態(tài)發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而改變分子多重性的過(guò)程，例如：S1*T1。特點(diǎn)：振動(dòng)能級(jí)重迭時(shí)，產(chǎn)生體系間跨越的可能大；跨越后，熒光量子減弱，甚至?xí)晒庀纭Ｓ绊懴甸g跨越的因素：▲含重原子如碘、溴等的分子，體系間跨越最為常見(jiàn)?！谌芤褐写嬖谘醴肿拥软槾判晕镔|(zhì)也能增加體系間跨越的發(fā)生幾率。2.2.5熒光（Fluorescence)：電子由第一激發(fā)態(tài)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)而發(fā)射的光量子為熒光。特點(diǎn)：熒光的能量小于所吸收的紫外光的能量，故發(fā)射熒光的波長(zhǎng)比吸收的紫外光波長(zhǎng)更長(zhǎng)；時(shí)間約為10-9~10-7秒。第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ2第一電子激發(fā)三重態(tài)T1*能量基態(tài)S0第一電子激發(fā)單重態(tài)S1*第二電子激發(fā)單重態(tài)S2*

熒光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換磷光吸收吸收外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫λ1λ22.2.6磷光（Phosphorescence)：由第一電子激發(fā)態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)任一振動(dòng)能級(jí)發(fā)射的光量子為磷光。特點(diǎn)：磷光能量比熒光小，波長(zhǎng)比熒光長(zhǎng)；發(fā)射時(shí)間長(zhǎng)，約為10-4~10秒（原因是分子激發(fā)三重態(tài)的壽命較長(zhǎng)）。去活化輻射躍遷非輻射躍遷熒光磷光振動(dòng)馳豫系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換處于激發(fā)態(tài)的分子或原子通過(guò)碰撞，以熱能或動(dòng)能的形式消耗其能量，降低到較低能級(jí)，這種能級(jí)的變化叫無(wú)輻射躍遷。處于激發(fā)態(tài)的分子或原子通過(guò)發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光，以輻射的形式回到基態(tài)，這種能級(jí)的變化叫輻射躍遷

(光致發(fā)光)2.3無(wú)輻射躍遷與輻射躍遷熄滅或猝滅激發(fā)光去除后，熒光立即消失激發(fā)光去除后，磷光不會(huì)立即消失三、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3.1激發(fā)光譜（excitationspectrum)：不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)的熒光所得的光譜。即固定發(fā)射光波長(zhǎng)λem，依次改變激發(fā)波長(zhǎng)λex測(cè)熒光強(qiáng)度F，以F-λex作得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜3.2發(fā)射光譜（emissionspectrum)又稱為熒光光譜（fluorescencespectrum)：即固定激發(fā)光波長(zhǎng)λex，依次改變發(fā)射波長(zhǎng)λem測(cè)熒光強(qiáng)度F、以F-λem作圖得熒光光譜。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜3.3熒光光譜的特點(diǎn)3.3.1.斯托克斯位移（Stocksshift)：熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng)。原因：激發(fā)態(tài)分子由于內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換和振動(dòng)馳豫過(guò)程而迅速到達(dá)S1*電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，從而存在著無(wú)輻射能量損失。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜3.3熒光光譜的特點(diǎn)3.3.2.熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。原因：熒光發(fā)射發(fā)生于第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級(jí)，與分子激發(fā)至那一個(gè)電子能級(jí)無(wú)關(guān)（即使分子激發(fā)到高于S1*的電子態(tài)的更高振動(dòng)能級(jí)，可通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)馳豫等無(wú)輻射躍遷的形式釋放能量回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級(jí)）。*3.3熒光光譜的特點(diǎn)3.3.3.熒光光譜與激發(fā)光譜呈對(duì)稱鏡像關(guān)系。蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜（溶劑：環(huán)己烷）蒽的能級(jí)躍遷圖四、影響熒光強(qiáng)度的因素4.1熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系4.1.1躍遷類型結(jié)構(gòu)中有π→π*，n→π*；而n→π*引起是弱吸收，有時(shí)不足以發(fā)射熒光，只有分子只能夠存在共軛的π→π*躍遷，也就是K帶強(qiáng)吸收時(shí)，才可能有發(fā)生熒光。4.1.2共軛效應(yīng)：當(dāng)π電子共軛越長(zhǎng)，λex和λem都將長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度（熒光效率）也會(huì)增大。4.1.3剛性平面在同樣的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性和共平面性越大，熒光強(qiáng)度（熒光效率）也會(huì)增大，并且熒光波長(zhǎng)產(chǎn)生長(zhǎng)移。4.1熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系4.1.4取代基效應(yīng)①.給電子基團(tuán)能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。例如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等②.吸電子基團(tuán)會(huì)妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。例如：-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等鹵素取代基會(huì)隨著原子序數(shù)的增加而減少熒光效率，這可能是由于重原子效應(yīng)。例如：-R、-SO3H、-NH3+等③.對(duì)電子共軛體系作用較小的取代基對(duì)熒光的影響不明顯。4.2熒光與環(huán)境因素的關(guān)系4.2.1溫度溫度越高，熒光效率越??；反之，溫度越低，熒光效率越大4.2.2溶劑溶劑介電常數(shù)增大，極性增大，λ增大；溶劑粘度增大，φf(shuō)增大，F(xiàn)增大。溶劑含重原子或溶液、溶解氧（CBr4,C2H5I等），體系間跨越幾率增大。使φf(shuō)減小，甚至熄滅。4.2.3pH4.2.4熒光熄滅（fluorescencequenching)定義：熒光物質(zhì)與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或熄滅的現(xiàn)象。常見(jiàn)的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。

4.2.5散射光、拉曼光、瑞利光五、熒光分析與應(yīng)用當(dāng)EcL≤0.05時(shí)，經(jīng)泰勒級(jí)數(shù)展開(kāi)得：根據(jù)Beer定律：溶液產(chǎn)生熒光的光路示意圖5.1熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系5.2熒光分析技術(shù)及應(yīng)用近紅外熒光光譜儀汞離子熒光探針在活細(xì)胞的汞信號(hào)識(shí)別Nikon單分子熒光系統(tǒng)2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家埃里克·白茲格(EricBetzig)，德國(guó)科學(xué)家斯特凡·W·赫爾(StefanW.Hell)，美國(guó)科學(xué)家威廉姆·艾斯科·莫爾納爾(WilliamE.Moerner)，以表彰他們?cè)诔直媛薀晒怙@微技術(shù)領(lǐng)域取得的成績(jī)。六、熒光光譜儀吸收池光源檢測(cè)器單色器信號(hào)顯示系統(tǒng)單色器截去所有的激發(fā)光和散射光只允許熒光通過(guò)6.1熒光光譜儀光路和基本結(jié)構(gòu)激發(fā)光通過(guò)1）一般是先做一個(gè)紫外吸收，大體確定以下激發(fā)波長(zhǎng)，然后以最大吸收的波長(zhǎng)為激發(fā)，在熒光儀上掃描，先掃發(fā)射，在固定發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)再回來(lái)掃激發(fā)。2）選定一個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)（通常選擇常用的激發(fā)波長(zhǎng)——從同行文獻(xiàn)中找到，如果實(shí)在不知道，我建議先選取較短的波長(zhǎng)——光子能量更高，樣品受激發(fā)的可能性更大），獲得一張發(fā)射光譜，此時(shí)可以看到發(fā)射光譜中最大峰，獲得其波長(zhǎng)；選定該最大發(fā)光峰波長(zhǎng)，做激發(fā)光譜，也可獲得一個(gè)最大峰波長(zhǎng)；

選用激發(fā)光譜中的波長(zhǎng)，對(duì)樣品再次進(jìn)行測(cè)試發(fā)射光譜