大鼠中樞ghrelin和GHS-R的分布及其促胃腸動力作用,人體生理學論文Ghrelin是生長激素促分泌素受體(growthhor-monesecretagoguereceptor，GHS-R)的內源性配體，主要由胃黏膜組織中的泌酸細胞分泌。Ghrelin的生物學作用特別廣泛，可促進生長激素分泌;調節攝食和能量代謝;刺激胃動力和胃酸分泌;調節心血管功能等。新近研究發現，ghrelin與消化道運動關系密切，外周和中樞給予ghrelin可加速胃排空，改善術后腸梗阻，促進胃和十二指腸消化間期復合肌電活動。Gong等用蛋白印跡方式方法和聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction，PCR)技術發現GHS-R在大鼠的下丘腦有表示出;Gnanapavan等用PCR技術證實，ghrelin和GHS-R在人的胃、小腸、結腸、胰腺、膽囊、肺臟、垂體、卵巢、血管等處均有表示出;Dass和Xu等利用熒光免疫組織化學方式方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結腸也發現了ghrelin及其受體。然而，關于ghrelin和GHS-R在中樞的組織細胞學分布及表示出量的比擬尚未見報道。除此之外，由于新鮮腦組織比擬難以斷定各核團的精到準確界限，PCR及蛋白印跡技術只能分離出大鼠的部分腦區(如海馬和下丘腦)，不能分離出華而不實包括的微小核團和亞核團，并進行表示出量比擬。因而，作者采用免疫組織化學和圖像分析方式方法觀察大鼠中樞ghrelin和GHS-R的分布，重點分析比擬二者在與消化功能相關腦區的表示出，為說明中樞給予ghrelin的促胃腸動力作用提供理論根據。1材料與方式方法1．1實驗動物健康純種Sprague-Dawley大鼠8只，雌雄不拘，體質量220～240g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。1．2主要試劑與儀器兔抗人GHS-R抗體購自美國SantaCruz公司，兔抗鼠ghrelin抗體購自美國鳳凰生物制品有限公司，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(strept-avidin-biotincomplex，SABC)羊抗兔免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德公司，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自北京中山生物技術有限公司，Q550CW型圖像采集與分析系統購自德國Leica公司。1．3取材與標本制備實驗大鼠用含100gL－1的水合氯醛400mgkg－1腹腔注射麻醉，經左心室穿刺至主動脈，用生理鹽水快速沖血管，含40gL－1的多聚甲醛緩沖液經升主動脈灌注。取出大腦和小腦，切成厚4mm小塊，40gL－1的多聚甲醛緩沖液固定8h，用含質量分數20%～30%的蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍后，組織包埋劑包埋，恒冷冰凍切片機切片。腦片行連續切片，厚15m。1．4免疫組織化學染色用SABC法進行ghrelin和GHS-R的免疫組織化學染色。詳細步驟如下:冷凍切片用磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)浸泡5min，參加檸檬酸緩沖液(pH6．0)，微波修復，晾至室溫，PBS沖洗3次，每次5min;體積分數3%的過氧化氫溶液(hydrogenperoxide，H2O2)浸泡30min，PBS沖洗3次，每次5min;體積分數0．5%的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)浸泡20min，PBS沖洗3次，每次5min。體積分數10%正常山羊血清封閉(37℃，30min)，甩去多余液體，切片分別滴加兔抗鼠ghrelin抗體(1:2500)和兔抗人GHS-R抗體(1:100)，4℃過夜，PBS沖洗3次，每次5min，滴加羊抗兔抗體(37℃，40min)，PBS沖洗3次，每次10min，滴加生物素化的辣根過氧化物酶復合物(avidin-biotinylatedhorseradishperoxidasecomplex，ABC)(37℃，20min)。PBS沖洗3次，每次10min，DAB顯色，中性樹膠封片，用圖像分析系統觀察ghre-lin和GHS-R陽性表示出。用PBS代替一抗做陰性對照，其余步驟不變。本實驗選取與消化功能相關的核團進行重點觀察，并分析了ghrelin和GHS-R陽性反響細胞在各核團不同分區的表示出。中樞陽性細胞計數:每只大鼠計數5張切片，每張切片在陽性細胞最密集處隨機選取5個視野計數，取平均值作為該切片的陽性細胞數。對每只大鼠同一腦區的ghrelin和GHS-R陽性細胞記數時必須選擇在一樣平面。1．5統計學處理應用SPSS13．0統計軟件進行數據分析，免疫反響陽性細胞數以均數標準差(x珋s)表示，多組間比擬采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。2結果2．1Ghrelin與GHS-R免疫陽性細胞的染色特征在大鼠中樞神經系統，ghrelin與GHS-R免疫陽性細胞廣泛分布于多個腦區，二者的陽性表示出類似，陽性細胞為細胞膜和(或)細胞質有棕黃色顆粒沉著，細胞核無棕黃色顆粒沉著。二者的免疫強陽性反響在大腦皮質、下丘腦、丘腦室周核、海馬(hippocamp，HIP)、杏仁核、小腦及腦干等部位均可見(圖1、圖2)。【圖1-2略】2．2Ghrelin和GHS-R免疫陽性細胞在與消化道功能相關腦區的表示出在下丘腦區室旁核(periven-tricularnucleus，PVN)、弓狀核(arcuatenucleus，ARC)、視前核(preopticnucleus，PON)、視上核(su-praopticnucleus，SON)、下丘腦外側區(lateralhypo-thalamicarea，LH)、下丘腦腹內側核(ventromedialhypothalamicnucleus，VMH)、下丘腦背內側核(dor-somedialhypothalamicnucleus，DMH)、下丘腦背側核(dorsalhypothalamicnucleus，DO)等處均可見ghre-lin及GHS-R陽性反響細胞。陽性細胞的細胞膜為棕黃色顆粒沉著，細胞核無棕黃色顆粒沉著。華而不實，ghrelin在PVN和LH陽性反響最強，免疫反響陽性細胞數分別為116．317．76和107．028．80，明顯高于ARC(75．125．59)、DMH(56．847．07)和VMH(62．546．93)，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖1、圖3);GHS-R在PVN和ARC陽性反響強，免疫反響陽性細胞數分別為111．0611．80和97．0610．37，明顯高于LH(74．706．04)、DMH(58．657．28)和VMH(48．246．58)，差異有統計學意義(P＜0．05);陽性細胞染色深，數目多，細胞體呈圓形或橢圓形，多數細胞有粗短突起。其余核團陽性細胞數目較少，分布稀疏，染色呈淡黃色(圖2、圖3)。【圖3】Ghrelin和GHS-R在HIP的CA1、CA2、CA3、CA4區的顆粒層均有分布，細胞多數呈橢圓形，細胞膜呈深棕色，細胞體較小，分布密集。華而不實，ghrelin在CA3區陽性反響最強，免疫反響陽性細胞數為123．2011．17，明顯高于CA1(67．466．93)、CA2(37．915．21)、CA4(59．966．73)區，差異有統計學意義(P＜0．05)(圖1、圖4);GHS-R在CA3和CA4區均有強陽性反響，免疫反響陽性細胞數分別為103．799．23和86．487．25，明顯高于CA1(51．166．56)、CA2(43．395．11)區，差異有統計學意義(P＜0．05)。錐體細胞層可見二者的強陽性反響(圖2、圖4)，細胞膜著深棕色，細胞體較大，呈圓形、橢圓形或錐形，突起粗短，著色明顯，細胞質淡染。二者在分子層均未見著色。【圖4】在杏仁核區，ghrelin和GHS-R陽性細胞細胞膜和(或)細胞質為棕色顆粒沉著，細胞核不著色。二者均在杏仁內側核(medialamygdaloidnucleus，Me)呈強陽性反應，免疫反應陽性細胞數分別為140．229．07和115．667．35，明顯高于杏仁基底內側核(basomedialnucleusoftheamygdale，BM)(67．847．36)、杏仁基底外側核前部(anteriordivi-sionofthebasolateralnucleusoftheamygdale，BLA)(33．464．24)、杏仁基底外側核后部(posteriordi-visionofthebasolateralnucleusoftheamygdale，BLP)(43．066．24)、杏仁核(centralamygdaloidnu-cleus，CeA)(22．583．60)、杏仁外側核(laterala-mygdaloidnucleus，LA)(31．955．77)，差異有統計學意義(P＜0．05)(圖1、圖2、圖5)，細胞體多數呈橢圓形，細胞膜為深棕色，很多細胞有短粗突起。Ghrelin在BLA與BLP也有較多陽性細胞，細胞體較大，有短粗突起，形態以圓形居多，細胞膜染色呈淡棕色。GHS-R在BM有較多陽性細胞，細胞體較小，呈圓形或橢圓形，染色呈棕黃色。在CeA和LA，二者的陽性細胞數目較少，細胞體較小，染色呈淡黃色。2．3Ghrelin和GHS-R免疫陽性細胞在中樞其他部位的表示出在大腦皮層區，各層均有ghrelin與GHS-R陽性反響細胞。二者在分子層、外顆粒層、多形細胞層陽性反響均較弱，染色呈淡黃色，陽性細胞輪廓不清楚明晰，體積較小，形態以圓形和橢圓形居多，還可見梭形細胞。在內顆粒層和外錐體細胞層，ghrelin陽性反響較強，陽性細胞呈棕黃色，輪廓清楚明晰，形態呈圓形或橢圓形，無突起染色，細胞核不著色。GHS-R陽性表示出在外錐體細胞層較多，內顆粒層較弱。在內錐體細胞層，GHS-R和ghrelin陽性反響均較強(圖1、圖2)，細胞呈棕黃色，突起染色明顯，細胞核不著色，形態多為錐形。【圖5】在小腦蒲肯野細胞，ghrelin與GHS-R均呈強陽性反響(圖1、圖2)，細胞胞體大，呈梨形，細胞膜和細胞質著深棕色，突起無明顯著色。二者陽性反響在小腦的分子層和顆粒層較弱，細胞小而圓，細胞膜和細胞質呈棕黃色。除此之外，在前庭神經上核、外側核、中縫核、小細胞網狀核和面神經核等處均可見ghrelin和GHS-R陽性細胞。在延髓，ghrelin與GHS-R均有強陽性反響(圖1、圖2)，細胞膜和細胞質呈深棕色，細胞體呈多形性，有明顯突起。在孤束核、迷走神經背核、延髓網狀核及最后區等處可以見ghrelin和GHS-R陽性細胞。3討論新近研究發現，ghrelin與消化道運動關系密切，可促進攝食和胃排空，增加胃酸分泌，加速小腸轉運，有效改善術后腸梗阻。近來的研究多關注于ghrelin的組織分布，已有研究發現，ghrelin在胃腸道和中樞神經系統均有分布，主要由胃黏膜內分泌細胞(主要為X/A樣細胞)分泌，在小腸、腎臟、下丘腦、腺垂體、胰腺、甲狀腺、心臟、卵巢及胎盤等處也有少量分泌，可通過內分泌或旁分泌形式作用于受體，在局部發揮作用。但對其受體GHS-R分布的研究并不充分。以往研究發現，GHS-R主要分布于垂體、下丘腦和胃，在心臟、肺、胰腺、腸、脂肪組織及腎也有分布，介入調節內分泌與能量代謝。當前，關于二者在中樞各腦區的組織學定位及微小核團和亞核團的表示出水平比擬尚未見報道。作者就此進行了進一步研究，并重點分析了二者在與消化功能密切相關腦區的表示出水平比擬。研究結果顯示，GHS-R在大鼠中樞廣泛存在，陽性細胞細胞核不著色，細胞膜著黃色或棕黃色，細胞質有少量著色，主要分布于大腦皮質、下丘腦、丘腦室周核、HIP、杏仁核、小腦及腦干等部位。以往研究用蛋白印跡法和PCR技術證實GHS-R在中樞和外周均有表示出，用熒光免疫組織化學方式方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結腸腸神經叢也發現ghrelin及GHS-R。本研究結果與其結果相符，并在這里基礎上進一步觀察了二者在與消化功能密切相關腦區(包括核團及亞核團)的表示出。下丘腦位于間腦的腹側部，構成第3腦室下部的底壁和側壁。除介入神經內分泌、水電解質代謝和體溫調節等功能的調整，下丘腦也是調節攝食和消化道運動的重要中樞。下丘腦從前向后分為3個區:視上部位于視穿插上方，由SON和PVN組成;結節部位于漏斗的后方;乳頭部位于乳頭體。下丘腦與其他腦區有復雜而廣泛的纖維聯絡，它不僅接受來自大腦皮質、邊緣系統、腦干的傳入纖維，還發出大量的纖維到達大腦皮質、邊緣系統、中腦、腦橋和延髓。下丘腦能通過3種途徑對機體進行調節:(1)由下丘腦核發出的下行傳導束到達腦干和脊髓的植物性神經中樞，再通過植物性神經調節內臟活動;(2)下丘腦的SON和PVN發出的纖維構成下丘腦-垂體束到達神經垂體，兩核分泌的加壓素(抗利尿激素)和催產素沿此束流到神經垂體內儲存，在神經調節下釋放入血液循環;(3)下丘腦可分泌多種多肽類神經激素對腺垂體的分泌起特異性刺激作用或抑制作用，稱為釋放激素或抑制釋放激素。近來研究發現，ghrelin的促胃腸動力作用與下丘腦密切相關，下丘腦ARC可介入調節其促動力作用。以往研究證實，大鼠腦內存在ghrelin和GHS-R，主要分布于下丘腦，但并未研究其在下丘腦主要亞核團的表示出。本研究結果顯示，ghrelin和GHS-R免疫陽性細胞在下丘腦PVN、ARC、LH、VMH、DMH等處均有分布。Ghrelin免疫陽性細胞在LH和PVN居多，GHS-R免疫陽性細胞在PVN和ARC居多。這提示在消化道運動的調節中，下丘腦發揮著重要作用，ghrelin可能通過PVN、ARC及LH發揮其生理學作用。HIP不僅與認知功能如學習、情感、記憶有關，也是調節內臟活動的重要中樞，它與下丘腦、杏仁核、延髓髓質有著極其復雜的互相聯絡，在調節哺乳動物的進食行為、飽感及胃腸運動中發揮著重要作用。HIP構造由HIP本部、齒狀回、下托、束狀回和灰被組成。它從室間孔處延至側腦室下腳頂部，全形呈弓形。根據HIP本部的細胞構筑可再將其劃分為4個亞區，分別命名為CA1、CA2、CA3及CA4區，CA4區與下托相連接。齒狀回的皮質分為分子層、顆粒層和多形層。本實驗研究結果顯示，GHS-R免疫陽性細胞在HIP各區均有分布。HIP在解剖構造上屬于邊緣前腦皮質構造，邊緣系統不是一個獨立的解剖學和功能性實體，它是管理學習經歷體驗、整合新近與既往經歷體驗，同時啟動和調節種種行為和情