2022甲狀旁腺腫瘤診斷中兩種IncRNA評分模型的構建(全文)摘要目的本課題組前期芯片研究發現，ENST00000538790.NR.125790等長鏈非編碼RNAQncRNA)在甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤組織標本中的表達存在明顯差異，本研究進一步探討ENST00000538790及NR」25790等IncRNA及其構建的IncRNA評分模型在甲狀旁腺癌中的診斷價值。方法收集57例甲狀旁腺功能亢進患者的新鮮組織標本，n例為甲狀旁腺癌,46例為甲狀旁腺腺瘤，采用實時定量PCR(RT-qPCR)技術檢測IncRNAENST00000511928.ENST00000538790.ENST00000618339.NR.125790及ENST00000485384的表達差異，構建IncRNA評分模型，評估模型在甲狀旁腺癌診斷中的價值。結果相比甲狀旁腺腺瘤，ENST00000511928及ENST00000538790在甲狀旁腺癌組中表達顯著升高(P<0.05),ENST00000618339>NR.125790及ENST00000485384表達明顯下降(&0.05),其中ENST00000538790及NR.125790為甲狀旁腺癌的獨立危險因素(P<0.05)?聯合ENST00000538790及NR.125790構建的IncRNA模型”log評分它logistic決令”在甲狀旁腺癌中受試者工作特征曲線下面積分別為0.935及0.943，且曲線下面積大于ENST00000538790與NRJL25790及血鈣等傳統臨床診斷指標單獨診斷面積(戶V0.05)。結論以IncRNAENST00000538790及NR.125790構建的IncRNA評分模型有可能成為甲狀旁腺癌診斷的潛在輔助手段。原發性甲狀旁腺功能亢進癥(primaryhyperpara-thyroidism,簡稱原發性甲旁亢)，是內分泌系統常見疾病之一。原發性甲旁亢患者術后病理診斷中甲狀旁腺腺瘤(parathyroidadenoma)最為常見(80%左右)，甲狀旁腺癌(parathyroidcarcinoma)相對罕見。但甲狀旁腺癌對放化療不敏感，易出現高鈣危象、術后復發，預后更差⑵。近期報道發現，甲狀旁腺癌有逐年增加趨勢。國內研究發現，甲狀旁腺癌占比達6.48機3】。通常，甲狀旁腺癌只有在復發、包膜浸潤、淋巴結或遠處轉移時才能被診斷⑵。單純臨床及術后組織病理早期精準診斷甲狀旁腺癌極為困難，造成漏診率、誤診率居高不下⑷。本課題組前期將甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤組織進行長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,IncRNA)-信使RNA(messengerRNA,mRNA)芯片掃描，篩選腫瘤通路相關的差異InRNA,進行甲狀旁腺癌相關機制研究，但未進行標志物篩查【5】o因此，為尋求更加高效的診斷標志物，本課題組重新分析芯片數據，選擇升高(ENST00000511928.lnc-GLI3-4:1及ENST00000538790)以及降低(ENST00000618339.NR.125790及ENST00000485384)中位居前3位的IncRNA進行重新驗證比較，并構建IncRNA評分，為尋找甲狀旁腺癌潛在診斷標志物提供理論依據。對象和方法一、對象本研究為病例對照研%共納入原發性甲旁亢患者57例，其中男性20例女性37例，平均年齡為(58.26±12.96)歲，術前血鈣為⑵86±0.05)mmol/L、甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)為(575.25±80.01)pg/mL.其中，甲狀旁腺癌患者11例，甲狀旁腺腺瘤患者46例。所有患者的診斷由2名病理學專家完成。當患者出現局部浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移或復發時可診斷為甲狀旁腺癌。所有術中新鮮標本均凍存于-80。(：冰箱。本研究通過北京世紀壇醫院倫理委員會審查，同時患者已經簽署知情同意書。二方法1.IncRNA選擇為保障實時定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)驗證的成功率，選擇高表達組中歸一化分析后信號值仍然大于7且升高及下降倍數中居前3位的IncRNA,其中lnc-GLI3-4:1的序列與INHBA基因重合，驗證中不能區分兩者，故除去該指標。2.RNA提取及逆轉錄：與本課題組前期工作中描述的提取組織標本的總RNA類似根據說明書操作步驟采用TRIzol試劑提取法(InvitrogenLifeTechnologies，美國)[6]。提取出的總RNA使用Nanodropspectrophotometer(ThermoFisherScientific，美國)檢測A260/A280比值以評估RNA質量.進一步通過Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies，美國)檢測RNA完整值(RNAintegritynumber,RIN)評估RNA的完整性。所有標本提取出RNA的RIN值大于7.O0隨后使用ReverTraAceqPCRKit（TOYOBO,FSQT01）試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄程序為37。（：維持15min后，98°C維持5min,最后4o（：終止反應。3.RT-qPCR:根據說明書的操作步驟，使用PowerSYBRGreenPCRMasterMix（ABI,4368708）試劑在7900HTSequenceDetectionSystem（ABI,美國）系統中進行PCR反應。PCR引物設計見表10程序設定為5CTC維持2min,95。＜：變性10min，隨后進行40個循環（95°C維持15min,60°C維持1min）。每次實驗獨立重復3次，采用ACt法分析IncRNA相對表達量。表1引物序列設計Tab1Sequencedesignforprimers基因Gene上游引物Fbrwardprimer下游引物ReverseprimerENST000005119285-GCCirGAATGCGTAGCTTTC-35-GCGnGGCAGAGGCAGn-3ENST000006183395JCATTTGTCATCTTCTTGTTGGATCA-3.5/TGCAGGGTACAAGGCCAATAT3ENST(XMXX)618339y-CATHGICAICIIIIIGHGGAICA-3'5-TGCAGGGTACAAGGCCAATAT-3NR_I2579OS^AAATCTGAAGCCACAAATACATTG-S,5-1Vr?AAAGTGACGGATCTTTT-3ENST(XXMXM853845-TTGGGACAAACCAAAGAATTGA-35-ATCCiTGGCTAGGTCTCTCATTTC-3CCND25-GGTGTCTGTTTGGTCAGGATGTT-35-AAACCTnTCGCATACACTGATCA-3BCL7A5-GCTGCGGCTACACATTCCA-35-CACAGCCnCCGGGTTGT-3GAPDH5-TGACTTCAACAGCGACACCCA-35-CACCCTGnGCTGTAGCCAAA-3注：CCND2:周期強白2CyclinD2;BCL7A:晦胞慢性淋巴綢胞性白血病/淋巴I87AB,cellchroniclymphocyticIcukcmia/lymphiima7A三、統計學處理定性資料采用數值或百分比表示，定量資料采用Mean土SD表示，符合正態分布及方差齊性的2組資料比較使用t檢驗不符合正態分布及方差齊性的樣本使用非參檢驗Mann-WhitneyU檢驗。x2檢驗用于分析定性資料的差異及相關性，Spearman相關性檢驗用于分析IncRNA與臨床指標的相關性，使用logistic回歸分析甲狀旁腺癌的危險因素。“log評分”模型的建立參考本課題組前期發表文章中的模型，根據以下公式計算得出："log評分”=(IncRNAENST00000538790-RQ)X(1/NR_125790-RQ)o其中,RQ為IncRNA相對表達量(relativequantity),即Iog2轉換后的IncRNA表達量[5]。此外，近期有學者通過logistic回歸模型亦構建出miRNA在甲狀旁腺癌中的診斷模型，故本研究中亦通過logistic回歸模型構建第二種IncRNA模型："logistic評分”艮Pln[P/(l-P)]=1.876-1.298xACtENST00000538790+l.225xACtNR_125790o其中，口為甲狀旁腺癌的概率，Ct值為RT-qPCR檢驗中的檢測基因的循環閾值(cyclethreshold),ACt=CtlncRNA-CtGAPDH[7]e上述統計學分析均由SPSS19.0(IBMCorp,美國)軟件完成,圖片由Prismv6.0(GraphPad,Inc)軟件繪制。受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線用于評估IncRNA的診斷效能，Z檢驗用于R0C曲線下面積(areaundercurve,AUC)的比較，上述檢驗使用MedCalc(MedCalcSoftware,Belgium)軟件完成。P<0.05為差異有統計學意義。整甬淋WDCRNAffl-ff天曲弗宅醐-&洲辱aa耕串沏丑群?豐馴對添畝eDlll理3§—ncRNA南段并與戟BS院翔)5iMffi*DnF如<蜥2)。sInc-GLW4Lnll，M沙5漏DcRNAmRT2PCR刈攜-B-S洲辱?澹m#湃鄒沏3一贈<B1>senstooooo511928(paool)對ENST00000538790(PAp01)ffl丑井迎弗圃滯壬洲呼削岫豐醐、ENST00000618339(PH0013kNR一12579。(pn。-oo4>51,郅翌己豐M用-71赧照&恥潸s3月S=i/ATab2Top5reeIncRNAmos—UD」remularcdanddowrlAcmuETrcd喜Chromosome先nchangeHsup，rcg=a-cd黑斑剁米第Da~abascsourceENSTOOOOOS=928Chr42626一nc,GU34一?■/ENSfMBLIGENCODEChr717.50

有合88LongnorxodingRNA§2§3二6g81IncRNA的表達SExpressionofIncRNA—(ACt)05 344_flSNYfirffm.n.ialggsHS93B?J-to>0OTV2b*a2HMXSBBrKSHires?■>?-7&m319-B389V918fisISP5n圖1運用RT-qPCR技術檢測甲狀旁腺癌和甲狀旁腺腺瘤中IncRNA的表達差異Fig1ExpressionofIncRNAsinparathyroidcarcinomaandparathyroidadenomadetectedbyRT-qPCR二、納入評分模型的IncRNA的選擇單因素分析發現，除ENST00000618339外，其余4條IncRNA均與甲狀旁腺癌密切相關俵3)。進一步進行多因素回歸分析，發現僅有ENST00000538790及NR.125790與甲狀旁腺癌存在獨立相關性(表3)。相關性分析發現,其他3條IncRNA均與ENST00000538790及NRJL25790存在一定程度的相關(P<0.05)。故本研究只納入ENST故000538790及NR.125790進入IncRNA評分模型。表3單因素及多因素分析IncRNA疽甲狀旁腺癌的相關性Tab3UnivariateandmultivariateanalysisforIncRNAsinparathyroidcancerLncRNA單因素分析Univariateanalysis多因素分析Multivariateanalysis㈣㈣95%o)P95%Q)PENST000005119282.799(1.512A5.180)0.0011.253(0.610A2.577)0.539ENST(XXXM)53879()2.070(1.2657.385)0.0042.809(1.050-7.515)0.040ENST000006183390.827(0.675-1.012)0.0650.694(0332-1.452)0.869NR.125790O.553(O,363A).842)0.0060386(0.154AO,967)0.042ENST000004853840.545(0.365-0.816)0.0030.849(0.43521.659)0.333,：IncRNA:超3讖碼RNALongnonvodingRNA三、IncRNAs與臨床特征之間的相關性分析相關性分析納入模型的2條IncRNA與患者臨床特征，發現IncRNAENST00000538790水平與患者堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)呈正相關(P=0.026),NRJ25790表達量與腫瘤直徑呈負相關(P=0.030),與術

前血鈣、白蛋白校正后血鈣、血磷及患者年齡均無明顯相關性（表4）。￡4LneRN佑漁嘲相關住分析Tab4CorrelationanalysisinIneRNAsandclinicalcharactersIneRNAflKScrumakiumrPaSQKitfunafiAlbumknadjustedscrumakiumr P甲U*M?Para?hyroWhormoner P臨Serumphosphocusr Pf曼腳聾Mkaiinephosphataser P4*Ager PMBSDiameterrPENST(XXMX)53K790NR.1257900.1560245-0.1510.2610.060?0.04906560JI80.181?0.069 0A08?OXI13O.92IQI630.2260294 0.0260.145 0283?0.063OM0.11603890.06S0.632*02880.0303：heRNA:LongnorKOdingRNA四、2種IneRNA評分模型構建及其診斷價值評估LneRNAENST00000538790診斷甲狀旁腺癌的AUC為0.864(95%CI0.726-0.928,P<0.001;圖2A),IneRNANR.125790的AUC為0.783(95%CI0.653-0.881,P<0.013)o納入上述2條IneRNA,構建“log評分"。“log評分”模型的AUC為0.935(95%CI0.837?0.983,PvO.001；圖2A),其診斷靈敏度為90.91%,特異度為84.78%。進一步比較發現，”log評分”模型的AUC高于NR125790單獨診斷的AUC(P=0.015)o—log評分logscore—hgistieVf'flogislicscore——log評分logscore—hgistieVf'flogislicscore—ENSTOOOOO53879O—/Ogtsbc評分logisticscore臨床指標聯合Combinationofclinicalindices—NR125790-血鈣Scrumcalcium理. MMWJ2579e(2㈣..W**H*?AUG?f-2?aQMrcW*K*K*MAEm$TWOQO5-?WCMt.U5?W;EM)AUG91thantherahanMMAm.USM?tarenasgjnatn(小。5MunwiMvAlXncmn(AsK—MmWMithawhemt?oIrdUUsifKMy:.AvoaA***=*W??r*4K-CBT<?THunMMiAXillf依龜 WJAAifrxxnljg, >■? ? ? 1■ . ..r TI ? □? ?? ■■ ????<■tOTior2LncRNA在診斷甲狀旁腺癌中的ROC曲線Fig2ROCcurvesforIncRNAsinparathyroidcarcinomadiagnosis此外，通過logistic回歸分析構建另外一種IncRNA評分一一"logistic評分”。“logistic評分”模型的AUC(0.943,95%CI0.847-0.987)明顯高于ENST00000538790(P=9049)及NR_125790(P=0.022)單個IncRNA的AUC。"logistic評分”模型診斷甲狀旁腺癌的靈敏度為90.91%、特異度為89.13虬同時JncRNAENST00000538790與NR.125790的AUC無差異(P=0.507)o術前PTH、血鈣、腫瘤直徑及在診斷甲狀旁腺癌中的AUC分別只有0.711(95%CI0.5750.824).0.661(95%CI0.522-0.782)及0.675(95%CI0.536-0.794),聯合上述三個指標(PTH、血鈣、腫瘤直徑)構建成的"臨床指標聯合”的AUC可提高至0.735(95%CI0600~0.844)。進一步分析發現，本研究中構建的"log評分”診斷甲狀旁腺癌的AUC明顯高于PTH(P=0.043)、血鈣(P=0.021)、腫瘤直徑(P=0.038)及"臨床指標聯合"(P=0.044)o"logistic評分”的AUC與PTH(P=0.005)、血鈣(P=0.001)、腫瘤直徑(P=0.002)及"臨床指標聯合”(P=0.006)相比也明顯增高(圖2B)。五、IncRNA對應靶基因的驗證為進一步探討IncRNA在甲狀旁腺癌中的作用機制，通過UCSC基因組瀏覽器(http://genome,/)>BLAST及RNAplex軟件預測IncRNA的靶基因，發現IncRNANR.125790可能通過Cis/trans這2種作用方式影響細胞周期蛋白2(cyclinD2,CCND2)基因的表達；ENST00000538790預測的靶基因為B細胞慢性淋巴細胞性白血病/淋巴瘤7A(B-cellchroniclymphocytic1eukemia/1ymphoma7A,BCL7A)基因。RT-qPCR結果顯示，甲狀旁腺癌組織中，CCND2(P<0.05,圖3A)及carcmoma;CCND2:90902CycfinD2:0Q7A:中典倒陸海|王曲■性白皿時/事巴?7AKellchromeMnphocyttcicukcfmaAmphofna7A;Mt=CUncRHA1AGAPOK：Ct:?^倩4CydcttwcshcM;vsPA.?氏0.05圖3運用RT-qPCR技術檢測甲狀旁腺癌和甲狀旁腺腺瘤中IncRNA靶基因的表達差異Fig3ExpressionofIncRNAsandtheirtargetgenesinparathyroidtumorsdetectedbyRT-qPCR討論目前，甲狀旁腺癌缺乏特異性的診斷標志物［8］o本課題組前期研究結果與以往其他研究結果類似，發現血鈣、PTH、腫瘤大小等傳統的臨床指標雖然在甲狀旁腺癌與甲狀旁腺腺瘤患者中存在差異，但診斷效能并不十分理想［9,10］。且有報道，我國甲狀旁腺癌術前誤診率高達80%以上，術中冰凍切片檢出率僅有15.04%，加之術后病理診斷亦存在很大困難，故亟需高效的診斷標志物［4］。已有研究表明，非編碼RNA在原發性甲旁亢發病中發揮重要作用。microRNA參與甲狀旁腺腫瘤中PTH釋放、鈣敏感受體表達及腫瘤形成等多個環節［11］。有研究表明,miR-139及miR-30b在甲狀旁腺癌組織中的表達與甲狀旁腺腺瘤中存在明顯差異，可能起到輔助診斷甲狀旁腺癌的作用［7］。但遺憾的是，miRNA相關研究并未轉化為甲狀旁腺癌的臨床診斷指標。而IncRNA與microRNA類似，亦不編碼蛋白，且長度大于200ntoLncRNA的出現為腫瘤性疾病的診斷提供了新的思路［12］oLncRNA在內分泌系統多個疾病中發揮重要作用［13］□其在甲狀腺癌中的研究引發越來越多的關注［6,14,15］o目前，關于IncRNA在甲狀旁腺中的探索才逐漸起步，本課題組將甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤組織進行IncRNA-mRNA芯片掃描，發現上千條IncRNA出現差異表達［5］。另有研究報道，IncRNAGLIS2-AS1及PVT1有望成為鑒別甲狀旁腺癌的分子標志物［16］?在本課題組的芯片研究中，GLIS2-AS1及PVT1差異存在統計學意義，但與其他基因相比，其差異排序并不靠前［5］。此外，有研究發現IncRNAR0R可能參與甲狀旁腺癌的發病，但其僅為小樣本量研究(甲狀旁腺癌共4例)［17］。為尋求更加高效的診斷標志物，本研究重新分析芯片結果，ENST00000511928及ENST00000538790(P<0.01)在甲狀旁腺癌組中表達顯著升高，ENST00000618339、NR.125790及ENST00000485384在甲狀旁腺癌組織中表達明顯降低。進一步分析發現，ENST00000538790及NRJ25790與甲狀旁腺癌密切相關，故將上述2條IncRNA通過2種不同的方式構建IncRNA評分模型。新構建的IncRNA評分模型診斷效能明顯優于2條IncRNA及血鈣、PTH、腫瘤直徑這些傳統臨床指標的獨立診斷效能。此外，與傳統免疫組化指標相比，部分腫瘤患者的血漿中IncRNA也會出現相應變化，如本課題組前期研究發現，IncRNAGAS8-AS1表達在甲狀腺癌患者血漿中下降，這可能在甲狀腺良惡性腫瘤的鑒別中發揮重要作用［15］o故本研究旨在為尋找甲狀旁腺癌的血漿標志物提供一定的理論基礎。此外，NR.125790與腫瘤大小呈負性相關，同時該IncRNA的表達量下降及腫瘤直徑較大時，甲狀旁腺癌的風險明顯增加。本課題組通過軟件預測IncRNANR.125790的靶基因為CCND2。Hung等［18］研究發現，在肺腺癌及乳腺癌患者標本中CCND2的mRNA表